莎莎寫于2020.5.13? 昨天寫RNAi學(xué)習(xí)手冊寫到一半太困了然年上床睡覺也沒睡著，一直在為實驗的事情發(fā)愁。然后剛好小伙伴問我要不要去實驗室，然后我們就一起去了細胞培養(yǎng)室做了細胞凍存，但是我現(xiàn)在沒有自己的細胞，所以我就要想辦法找?guī)熃阋恢旮伟┘毎?，然后要到之前先學(xué)習(xí)一下肝癌細胞是如何培養(yǎng)的吧。
1.實驗室常用肝癌細胞株
1、 SMMC-7721人肝癌細胞株
SMMC-7721細胞系是于1977年建立，材料取自一名50歲男性原發(fā)性肝細胞癌HCC患者的手術(shù)切除標本進行體外培養(yǎng)而得。其生物學(xué)特性如下: 細胞系生長較迅速穩(wěn)定，在原代細胞開始傳代階段增殖緩慢，以后趨于穩(wěn)定而迅速生長；細胞形態(tài)為上皮樣；貼壁生長；細胞的亞微結(jié)構(gòu)形態(tài)符合癌細胞的一般特征；甲胎蛋白(α-fetoprotein, AFP)免疫熒光染色呈陽性；LDH同工酶譜的變化與肝癌細胞的一般特征一致；免疫缺陷小鼠體內(nèi)可成瘤率高，動物異種后瘤結(jié)節(jié)經(jīng)病理切片檢查，其組織形態(tài)和原手術(shù)切除標本類似。
2、Bel-7402人肝癌細胞株
Bel-7402于1974年建立，來源于一位53歲男性肝癌患者的手術(shù)切除標本，屬于HCC。生物學(xué)特性如下: 細胞增長迅速而恒定，6-7 d可傳代1次；細胞形態(tài)以多邊形上皮樣占絕大多數(shù)；貼壁生長；細胞染色體中有一大而長的近端著絲點染色體，出現(xiàn)頻率高，是本株細胞的標記染色體；AFP免疫熒光反應(yīng)陽性；LDH、G6PD、TAT等酶代謝及細胞的超微結(jié)構(gòu)基本上保持臨床人體肝癌的特性；異種接種后成瘤率高，3-4d可成瘤，瘤塊組織學(xué)病理與臨床HCC相近。
3、 MHCC97人肝癌細胞株
該細胞系由上海醫(yī)科大學(xué)中山醫(yī)院建立, 將一名我國39歲男性HCC患者的肝右葉轉(zhuǎn)移病灶的手術(shù)切除標本接種于裸鼠肝內(nèi)建造出人肝癌裸鼠轉(zhuǎn)移模型(LCI-D20)而得。已證實, 經(jīng)過再次分離得到的MHCC97H、MHCC97L及HCCLM33種細胞株，依據(jù)它們的轉(zhuǎn)移特點，雖來源同一父系，但具有異質(zhì)性，即具有不同的轉(zhuǎn)移潛能。
MHCC97人肝癌細胞系于1998年從裸鼠人肝癌轉(zhuǎn)移模型(LCI-D20)體外傳代培養(yǎng)獲得，該細胞系符合一般人惡性腫瘤的病理學(xué)和遺傳學(xué)特征，細胞呈上皮樣，貼壁生長，血清HBsAg、AFP高表達，成瘤率高且優(yōu)先轉(zhuǎn)移的靶器官是肺，肺轉(zhuǎn)移率100%，故證實該細胞系為高轉(zhuǎn)移特性的人肝癌細胞系。
2001年，研究者從MHCC97細胞系中發(fā)現(xiàn)并分離出不同轉(zhuǎn)移潛能的2個細胞系MHCC97-H和MHCC97-L，前者肺轉(zhuǎn)移率100%，后者40%；從生長速度上，前者細胞倍增時間較后者短；穿透人工基底膜能力前者較后者大；前者均較后者活力強、代謝旺。傳代至20代后，兩種形態(tài)學(xué)特征及生長速度方面均較穩(wěn)定。之后又從MHCC97-H裸鼠接種后成功得到更高轉(zhuǎn)移潛能的HCCLM3細胞系。
4、HepG2人肝母細胞瘤
1979年，從阿根廷一名15歲高加索男孩的原發(fā)性肝胚細胞瘤中分離出并建立, 該細胞系呈上皮樣; 貼壁抱團生長; 生長較快, 傳代周期為1-2d; 低轉(zhuǎn)移; 裸鼠中成瘤率較差;AFP陽性; HBsAg陰性, 然而目前尚未證明該細胞中有乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)基因組; 但通過實驗已證實, 該細胞系分化程度較高, 細胞里代謝酶的生物轉(zhuǎn)化特性較完整, 不需加入外源性活化系統(tǒng)。在藥物作用相關(guān)研究中代謝酶保持穩(wěn)定, 不會因傳代次數(shù)增多而有所改變, 所含有的生物轉(zhuǎn)化代謝酶與人正常肝實質(zhì)細胞同源, 因此, 常被用于體外肝細胞代謝或遺傳毒性試驗方面的理想細胞系. 其中, HepG2.2.15是目前應(yīng)用較為廣泛的細胞株, 它是HepG2的衍生物是體外篩選抗HBV藥物的良好模型, 并用于抗HBV新藥開發(fā)的體外研究工具。
5、Hep3B人肝癌細胞株
Hep3B分離自8歲美國黑人男童的肝癌組織. 細胞形態(tài)跟HepG2類似, 呈上皮細胞, 電鏡下觀察胞漿里面很多粗大的黑顆粒, 同樣喜抱團貼壁生長; 其在裸鼠中能致瘤, 但基本不轉(zhuǎn)移. HBV陽性, 這與HepG2不同, 這株細胞整合了完整的HBV基因組，可用于HBV感染后發(fā)展致癌相關(guān)研究。
6、 Huh-7人肝癌細胞株
該細胞系于1982年從一名患有肝癌的57歲日本男性肝癌組織標本上培養(yǎng)而得。該細胞AFP陽性，高度分化, 細胞呈上皮樣, 貼壁生長. 特點是HBV陰性, 而具有丙型肝炎病毒(hepatitisC virus, HCV)易感性，故可用于HCV與肝癌的關(guān)系的研究. 除了用于研究致癌性, 還用于基因表達的調(diào)節(jié)機制、新陳代謝及VLDL的分泌等. 此細胞系的特別之處如下: 可用于生產(chǎn)重組蛋白如促紅細胞生成素; 在蛋白質(zhì)生物學(xué)方面用于研究在肝細胞內(nèi)復(fù)制的登革病毒; 廣泛用于異種移植動物模型.
7、 PLC/PRF/5人肝癌亞歷山大細胞
PLC/PRF/5人肝癌亞歷山大細胞于1976年建系, 細胞來自一位患有原發(fā)性HCC的莫桑比克男性患者的標本; 為上皮樣貼壁生長; AFP陽性, 不產(chǎn)生白蛋白; 分泌ad亞型的HBsAg而不產(chǎn)生HBcAg或HBeAg和Dane顆粒, 卻可維持HAV的繁殖; 該細胞可能含有全部HBV基因組, 同工酶譜及核型與人類同源;裸鼠異種移植可致瘤. 此細胞系因其產(chǎn)生HBsAg的物理化學(xué)和免疫化學(xué)特性跟HBV攜帶者血清中HBsAg相似, 因此, 可被用來研究HBV體外病毒及其與原發(fā)性肝癌的關(guān)聯(lián), 抗HBV疫苗所需的HBsAg顆粒的制備及抗病毒藥物的制備等方面。
人肝癌細胞系具有以下優(yōu)點：
首先，在選擇實驗對象的比較上，人肝癌細胞系相較于人原代肝細胞，克服了人原代肝細胞來源困難、實驗難控制、存活時間短的局限，肝癌細胞系為已獲得的穩(wěn)定傳代的細胞，具有來源方便、操作簡單、條件可控和可重復(fù)等優(yōu)點，是用于肝癌疾病相關(guān)研究的理想對象。
其次，肝癌細胞系均選擇來源于確診肝癌患者的病理組織，具有與肝癌患者體內(nèi)相似的遺傳基因組，其發(fā)生發(fā)展機制、功能蛋白表達、病毒復(fù)制能力、侵襲轉(zhuǎn)移功能及抗藥性等，具有與人類親源體極其相近的特點，因此更適合應(yīng)用于肝癌各領(lǐng)域的研究.
2.以HepG2/SMMC-7721為例做主要介紹：
3.BEL7402/hepG2/HCCLM等肝癌細胞培養(yǎng)過程
4.HepG2細胞培養(yǎng)的條件
HepG2人肝腫瘤細胞株廣泛應(yīng)用于遺傳毒理學(xué)及病毒培養(yǎng)等方面的研究,研究肝臟疾病發(fā)病機理及其臨床應(yīng)用有著重要意義。由于其與肝細胞具有相同的生物學(xué)活性，還被用于胰島素抵抗的研究。本文對肝癌細胞培養(yǎng)的最佳條件做一簡單綜述。
1.HepG2細胞的復(fù)蘇條件
1.1 復(fù)蘇溫度的選擇
唐孟萱等采用下述方法進行細胞復(fù)蘇：快速將所凍存細胞40℃水浴搖床60轉(zhuǎn)/ min慢搖至其溶解，溶解后馬上轉(zhuǎn)入 37 ℃水浴箱，手工慢搖恒溫 2～3min復(fù)蘇 ,復(fù)蘇后 800 轉(zhuǎn)/ min 離心 5min,吸去上清加入 10ml 含 15%胎牛血清 DMEM 培養(yǎng)基 ,混勻后加入細胞培養(yǎng)板 ,每孔 1 ml，5%CO2溫箱 37℃培養(yǎng)。唐孟萱等將上述方法與細胞專著所述方法相比較，傳統(tǒng) 37 ℃水浴方法復(fù)蘇后細胞存活率為 68.4%，先40℃溶解后37℃恒溫方法復(fù)蘇后細胞存活率為85.7%。證明其所用方法優(yōu)于傳統(tǒng)方法。
1.2 復(fù)蘇用培養(yǎng)基的選擇
鐘志宏等使用培養(yǎng)基培養(yǎng)基RPMI-1640和DMEM兩種培養(yǎng)基對HepG2細胞進行培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞結(jié)果在接種密度為1×104/cm2、血清含量為15%時，經(jīng)6h培養(yǎng)后細胞開始貼壁，12h后大部分細胞貼壁，且增值速度最快，4d后可以按1:3的比例傳代。
而用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞在接種密度為1×104/cm2、血清含量為20%時，時，經(jīng)6h培養(yǎng)后細胞貼壁不明顯，但12h后部分細胞貼壁，24h后亦大部分細胞貼壁，且增值速度相對較慢，5天后可以按1:3的比例進行傳代。以上結(jié)果說明，使用DMEM培養(yǎng)基既可以節(jié)省血清，細胞貼壁所用時間短、增殖速度快，并且傳代細胞培養(yǎng)也使用DMEM培養(yǎng)基，使用DMEM培養(yǎng)基進行復(fù)蘇，避免了配制不同培養(yǎng)基所帶來的麻煩，因此在HepG2細胞復(fù)蘇中推薦使用DMEM培養(yǎng)基。
1.3 復(fù)蘇時的接種密度
甘起霓等研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)接種密度為1×104/cm2，血清含量為20%時, 細胞24 后大部分貼壁, 且增殖速度最快, 5d后可按1:3比例傳代；當(dāng)接種密度大于1×104/ cm2和（或）血清含量少于20%時, 細胞表現(xiàn)為貼壁困難, 出現(xiàn)進行性退化; 當(dāng)接種密度小于1×104/ cm2 血清含量為20%時, 細胞24h后大部分貼壁, 但增殖速度明顯減慢, 約7d后才可按1:3比例傳代。
2.消化酶及消化時間的選擇
唐孟萱等研究發(fā)現(xiàn)，EDTA+胰酶的消化能力太強，消化時間不好把握，傳代消化后細胞死亡較多；EDTA消化能力太弱，消化時間太長且不易將細胞消化完全;用PBS將細胞洗3次，再加入 0.25%胰酶，覆蓋細胞約30s后吸去胰酶，37℃放置 2～3 min，顯微鏡下可觀察到細胞消化適度。鐘志宏等將待傳代細胞不用PBS洗滌和用pH7.2的PBS洗滌一遍、二遍、三遍后分別用0.25%的胰蛋白酶溶液、0.05%胰蛋白酶-0.53mmol/L EDTA.Na溶液進行消化（消化液用量為蓋滿瓶底），觀察時間為30秒，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分鐘。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：不用PBS洗滌的細胞分別用上述兩種酶消化，10分鐘后細胞仍然消化不完全。
用pH7.2的PBS洗滌一遍、二遍、三遍后的細胞，再用0.25%的胰蛋白酶溶液消化時，分別經(jīng)3分鐘、1分鐘和0.5分鐘能完全消化好細胞。而用0.05%胰蛋白酶-0.53mmol/L EDTA.Na溶液進行消化時，完全消化好細胞約需3分鐘、1.5分鐘、1分鐘。二者的結(jié)果相符。根據(jù)上述結(jié)果可知，在進行HepG2細胞的消化時，先用pH7.2的PBS洗滌三遍后，再用0.25%的胰蛋白酶溶液消化0.5分鐘效果比較好。費洪新[5]等人則推薦使用如下方法進行消化：果明顯，對細胞的影響小。一般適宜的消化方法是：用1×PBS將細胞洗滌2次 再加入適量的0.15%胰蛋白酶（含有0.02%EDTA并以7：3的體積比混合）覆蓋細胞約20秒后吸去胰蛋白酶 （含有0.02%EDTA并以7：3的體積比混合）。
3.培養(yǎng)基中血清濃度的選擇
由于人肝癌 細胞株生長緩慢，惡性程度較高，對于血清的要求比較嚴格，其培養(yǎng)時所需要胎牛血清的濃度要比一般的腫瘤細胞高一些。些經(jīng)驗，費洪新等人認為在含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中HepG2人肝癌細胞生長迅速。鐘志宏、王爽等人的實驗結(jié)果也支持上述結(jié)果。甘起霓則認為血清含量為20%時, HepG2細胞貼壁后增殖速度最快。當(dāng)HepG2細胞增殖數(shù)代后, 待其狀態(tài)穩(wěn)定時, 可將血清含量逐漸降至10%。唐孟萱[1]等人則認為12%的血清濃度足以滿足HepG2細胞的生長。
4.雙抗?jié)舛鹊倪x擇
王爽等通過正交實驗優(yōu)選發(fā)現(xiàn)，雙抗?jié)舛葹?.5%時傳代效果較好，條件易于控制，且細胞能順利生長。
5.培養(yǎng)基pH條件的選擇
鐘志宏等人實驗發(fā)現(xiàn)復(fù)蘇細胞和傳代細胞在pH6.8-7.4、5%CO2條件下培養(yǎng)，其貼壁和增值速度無明顯變化。
而無CO2條件下培養(yǎng)時，復(fù)蘇細胞在不同pH值條件下均表現(xiàn)為培養(yǎng)液逐漸變堿性，細胞不能貼壁，且逐漸縮小，退化；傳代細胞在不同pH值條件下培養(yǎng)，其培養(yǎng)液逐漸變酸性,當(dāng)pH值﹥7.0時，經(jīng)24h培養(yǎng)后，細胞基本貼壁，但增值緩慢，經(jīng)48h培養(yǎng)后大部分細胞已伸出偽足，細胞數(shù)量明顯增多；當(dāng)pH值﹤7.0時，細胞貼壁困難，經(jīng)72h培養(yǎng)后，細胞縮小、呈退化趨勢。王爽等通過正交實驗優(yōu)選發(fā)現(xiàn)，pH7.2時傳代效果較好，條件易于控制，且細胞能順利生長，與上述結(jié)果相符。
6.細胞傳代條件的選擇
王爽等通過正交實驗對HepG2細胞的傳代條件進行優(yōu)選，他推薦在細胞匯合度達95%-1000%時進行傳代。
唐孟萱等人的研究結(jié)果表明HepG2 細胞生長至匯合度50%～95%時是對數(shù)生長期,死細胞相對較少;而當(dāng)匯合度達到 100%時 ,生長趨于平臺期 ,死細胞數(shù)開始增加;特別是匯合度 100%以后再繼續(xù)培養(yǎng),死細胞數(shù)明顯增加而活細胞數(shù)減少。據(jù)此可確定 HepG2 細胞培養(yǎng)最佳的傳代時期是在匯合度 95%～100%之間。二者的實驗結(jié)果相符，推薦在匯合度在95%-100%時進行細胞傳代。
今天先學(xué)到這里啦，一會要去吃午飯，然后等老板通知叫我去找他，商量人生大事?。。∽Ｎ液眠\吧！?????
后續(xù)
- 我回來啦~ ??現(xiàn)在是晚上9點半，下午和老板從3點半聊到4點半，聊了好多，有實驗方面的，還有考博方面的~
- 師姐說：“HepG2,Huh7，hepa1―6，這是我現(xiàn)在有的，Hep 3B和MHCC97H這兩株在北京的李師姐那邊，H22訂了在路上”
- 我要做的細胞系：HepG2,Huh7，Hep 3B和MHCC97H，兩外兩株hepa1―6和H22是鼠源的暫時用不到
- 老板讓我補一下后面幾個circRNA的圖，我要去接著補圖了！明天又有一節(jié)生信課，到時候還是會這簡書記錄學(xué)習(xí)筆記！886ヾ(?ω?`)o??
