三十六策 第 12 策 革故鼎新
篩、猜 幾個(gè)分子，表型驗(yàn)證一下，按照套路把表達(dá)差異、一正一反、細(xì)胞動(dòng)物一做
查 lncRNA 序列也有一個(gè)權(quán)威數(shù)據(jù)庫叫 [noncode](file:///Users/gaoyuan/Desktop/%E4%B8%89%E5%8D%81%E5%85%AD%E7%AD%96/www.noncode.org)，在做研究的時(shí)候就要先進(jìn)行序列分析，證明它不編碼蛋白
ORF 開放閱讀框：從起始密碼子開始到終止密碼子，一段連續(xù)能編碼氨基酸的核酸序列，（分辨一段序列是不是非編碼，就是看它有沒有超過 100 個(gè)堿基長度的 ORF）
還有一種分析非編碼 RNA 序列特性的工具叫 CSF密碼子替換頻率，主要是看一段序列編碼的密碼子在不同物種之間的保守性。當(dāng) CSF 評分小于 0 的時(shí)候，就可以認(rèn)為他是一個(gè)非編碼
研究 lncRNA 的前置動(dòng)作也是篩猜分子
找一些有過報(bào)道的 lncRNA 分子，序列，引物，siRNA 都是現(xiàn)成的，把所有的關(guān)注點(diǎn)聚焦到分子是不是有新表型上。
lncRNA命名混亂
反義 AS： 反義是一類從編碼基因反向轉(zhuǎn)錄的 lncRNA
內(nèi)含子 IT： 在基因內(nèi)含子區(qū)域編碼的 lncRNA。
重疊 OT：是跨越內(nèi)含子和外顯子的 lncRNA。
長鏈基因間 lncRNA lincRNA，都是以大寫 LINC 為前綴數(shù)字為后綴，編碼區(qū)域位于兩個(gè)基因中間，不與編碼基因的內(nèi)含子和外顯子重疊。
與編碼基因是頭對頭挨著，推斷有雙向啟動(dòng)子，這些 lncRNA 用反義上游 AU做后綴
eRNA，是由基因的增強(qiáng)子編碼產(chǎn)生的，作用是促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄。
circRNA 是由特殊可變剪切產(chǎn)生的，主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，大部分來源于外顯子，少部分內(nèi)含子來源的 circRNA 存在細(xì)胞核中。circRNA 因?yàn)槌书]合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不易被核酸外切酶降解， 比線性 RNA 更加穩(wěn)定。circRNA 的表達(dá)水平具有種屬、組織、時(shí)間特異性，序列保守性比一般的線性 lncRNA 高。
篩分子，找序列，基礎(chǔ)表達(dá)，操作工具，細(xì)胞表型， 動(dòng)物表型和 Rescue。
第一步，檢測基礎(chǔ)表達(dá)做 RNA 水平檢測，實(shí)時(shí)定量 RT-PCR。 還可以FISH，熒光原位雜交
第二步，制備基因操作工具，核定位的 lncRNA 用 RNAi 做可能效果是很差，CRISPR 基因編輯技術(shù)直接把 lncRNA 的基因給 knockout 掉
第三步，細(xì)胞表型實(shí)驗(yàn)
第四步，動(dòng)物表型實(shí)驗(yàn)
第五步，表型的 Rescue 實(shí)驗(yàn)，把 CRISPR 敲掉后的細(xì)胞再過表達(dá) lncRNA 分子進(jìn)去。
因?yàn)橐徽环吹膬纱尾僮鞅缓喜⒌揭粋€(gè)實(shí)驗(yàn)里觀察，其他的干擾因素都沒有，只有觀察到分子上調(diào)或下調(diào)后表型出現(xiàn)或失去，這種因果關(guān)系的證明就更強(qiáng)了。單變量的 Rescue 實(shí)驗(yàn)可以替代一正一反，但是一正一反兩個(gè)實(shí)驗(yàn)不能替代 Rescue。
功能基因的 Rescue 利用密碼子的簡并性導(dǎo)入一個(gè)突變過表達(dá)載體， 可以使得過表達(dá)和 siRNA 干擾這兩個(gè)操作相互獨(dú)立。序列人為突變之后，讓蛋白的氨基酸序列保持不變，而 mRNA 序列可以發(fā)生改變，變得 siRNA 結(jié)合不上也就阻斷不了了。這樣的 rescue 效果是分子介導(dǎo)的功能表型之間發(fā)生抵消作用，而不是 siRNA 跟過表達(dá)載體的相互結(jié)合、無效化。
miRNA 作用于靶基因 mRNA 的 3’UTR，但是做下游靶基因的過表達(dá)的時(shí)候，只需要把 ORF 開放閱讀框克隆到載體里面，不加 3’-UTR，轉(zhuǎn)進(jìn)入的 Rescue 載體不受 miRNA 過表達(dá)的影響。如果表型回復(fù)成功了，就說明 miRNA 的表達(dá)和表型的關(guān)聯(lián)是依賴于這個(gè)靶蛋白變化的。如果表型沒變化，那就說明 miRNA 介導(dǎo)表型不是靠這個(gè)蛋白。
Rescue 就是這樣一種證明一個(gè)分子發(fā)揮功能依賴于另一個(gè)分子的實(shí)驗(yàn)策略
lncRNA，circRNA 的作用機(jī)制
第一，它可以作為 miRNA 分子海綿，像海綿一樣吸引結(jié)合 miRNA。
第二，它可以調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，跟轉(zhuǎn)錄因子關(guān)系密切。
第三，編碼小肽。
