??DNA就像纏繞在一起的繩索，包裝好的DNA被稱為染色質(zhì)，其內(nèi)部組織影響基因在每個(gè)細(xì)胞中如何發(fā)揮作用。核小體是由DNA與組蛋白形成的染色質(zhì)基本結(jié)構(gòu)單位，實(shí)際上通過(guò)移動(dòng)開(kāi)啟或關(guān)閉可閱讀的遺傳信息，核小體隨時(shí)處于動(dòng)態(tài)變化，這種狀態(tài)被稱為“染色質(zhì)的可及性”。上篇文獻(xiàn)中簡(jiǎn)要描述過(guò)Greenleaf實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的ATAC-seq技術(shù)可以快速高效的繪制染色質(zhì)開(kāi)放性圖譜。
標(biāo)題：A Single-Cell Atlas of In Vivo Mammalian Chromatin Accessibility
期刊：Cell
時(shí)間：2018/08/02
??這篇文章展示了如何通過(guò)單細(xì)胞的染色質(zhì)調(diào)控信息來(lái)研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控。從13只雄性小鼠的骨髓、大腸、心臟、腎臟、肝臟、肺、小腸、脾臟、睪丸、胸腺、全腦、小腦和前額葉皮層等多組織中采集了十萬(wàn)個(gè)單細(xì)胞，sciATAC-seq技術(shù)，檢測(cè)出了85種特異性染色質(zhì)的可及性狀態(tài)，并且其中大部分都能與特定細(xì)胞類型相匹。
??這項(xiàng)開(kāi)創(chuàng)性的工作由華盛頓大學(xué)的Jay Shendure教授（文章通訊作者）等合作團(tuán)隊(duì)完成，這個(gè)實(shí)驗(yàn)室主要開(kāi)發(fā)和應(yīng)用遺傳學(xué)，基因組學(xué)和分子生物學(xué)的新技術(shù)和方法，研究發(fā)育生物學(xué)，功能基因組學(xué)，人類疾病的遺傳基礎(chǔ)等方向，發(fā)表了大量CNS等高水平文章。
??目前高通量的單細(xì)胞ATAC-seq技術(shù)主要分兩種，一是在96孔板中通過(guò)split-pool-split的方法標(biāo)記單細(xì)胞，可以適用于大部分實(shí)驗(yàn)室但是數(shù)據(jù)質(zhì)量還有待提高，另一種是通過(guò)實(shí)驗(yàn)儀器形成單個(gè)液體來(lái)包裹單細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記, 依賴儀器但是數(shù)據(jù)質(zhì)量相對(duì)較好?？偟膩?lái)說(shuō)，單細(xì)胞數(shù)據(jù)信號(hào)噪音較高，分析需要大量統(tǒng)計(jì)學(xué)手段，這篇文章的一個(gè)亮點(diǎn)就是探索了很多新的數(shù)據(jù)分析方法，來(lái)試圖解析單細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄調(diào)控的問(wèn)題。這篇文章用到的是第一種混合編碼方式sciATAC-seq，由Jay Shendure組2015年開(kāi)發(fā)，分析上也提出了對(duì)單細(xì)胞ATAC-seq數(shù)據(jù)的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。利用LSI聚類，對(duì)每個(gè)cluster檢測(cè)特異peak，構(gòu)建單細(xì)胞信號(hào)矩陣。
??tSNE能夠通過(guò)染色質(zhì)信息將大部分不同組織來(lái)源的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。
??分析單細(xì)胞ATAC-seq數(shù)據(jù)的一個(gè)難點(diǎn)是怎么確定細(xì)胞的種類，文章結(jié)合浙江大學(xué)郭國(guó)驥教授發(fā)表的小鼠單細(xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù)，嘗試了基因種類分析，基因相關(guān)性打分和轉(zhuǎn)移標(biāo)簽等幾種不同的分析方法來(lái)探索這個(gè)問(wèn)題。并發(fā)現(xiàn)這些方法都各有優(yōu)劣。
??細(xì)胞類型特異的染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域信號(hào)與 Complex Sequence Grammar具有相關(guān)。
??最后文章基于小鼠單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析的結(jié)果推斷部分人類遺傳性疾病相關(guān)，受限于物種差異，以小鼠開(kāi)放染色質(zhì)的數(shù)據(jù)直接分析部分人類遺傳性疾病可能帶有一定局限性。
??最后附上 頡偉（清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院研究員，清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心PI，HHMI國(guó)際學(xué)者，國(guó)家“杰青”）專家在微信公眾號(hào)“BioArt”上的精彩點(diǎn)評(píng)：
??每個(gè)人體有幾十萬(wàn)億的細(xì)胞，而每個(gè)細(xì)胞在功能、形態(tài)等方面都是不同的。如何研究和闡明每個(gè)細(xì)胞的功能是生物學(xué)的基本核心問(wèn)題之一。單細(xì)胞RNA-seq的迅速發(fā)展大大增加了我們對(duì)已有細(xì)胞的認(rèn)識(shí)以及未知新的細(xì)胞類型的發(fā)現(xiàn)（國(guó)內(nèi)像湯富酬、郭國(guó)驥等實(shí)驗(yàn)室在這方面做出了杰出的貢獻(xiàn)）。然而RNA-seq信息中通常會(huì)缺失的一個(gè)重要信息是基因組調(diào)控序列。包括增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、絕緣子等調(diào)控序列是促成組織和發(fā)育時(shí)空特異性基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子?；谌旧|(zhì)的一系列表觀遺傳調(diào)控方法的進(jìn)步為研究這些問(wèn)題提供了很多新的工具。其中ATAC-seq是近年來(lái)比較常用的一個(gè)檢測(cè)染色質(zhì)開(kāi)放性的方法，這種技術(shù)是斯坦福大學(xué)的William Greenleaf和Howard Chang實(shí)驗(yàn)室于2013年開(kāi)發(fā)的。通常調(diào)控序列的染色質(zhì)會(huì)處于比較開(kāi)放的狀態(tài)，很適合比較廣譜的研究順式調(diào)控序列和基因表達(dá)調(diào)控。
??華盛頓大學(xué)的Jay Shendure實(shí)驗(yàn)室前期開(kāi)發(fā)了大量的單細(xì)胞研究工具，包括single cell ATAC-seq。在這個(gè)工作就是他們通過(guò)single cell ATAC-seq來(lái)研究小鼠多種組織單細(xì)胞水平的染色質(zhì)狀態(tài)和基因調(diào)控的研究做出的一個(gè)嘗試。 在技術(shù)上，作者采用index組合的方法，進(jìn)一步提高單細(xì)胞 ATAC-seq的通量。通過(guò)該方法，作者描繪了13個(gè)小鼠組織中大約100,000個(gè)單細(xì)胞的開(kāi)放染色質(zhì)圖譜，并且成功區(qū)分了諸多組織中的大部分細(xì)胞類群，也為相關(guān)組織的研究提供了很好的參考和借鑒。另外，作者通過(guò)單細(xì)胞 ATAC-seq的數(shù)據(jù)，鑒定了許多組織特異性的轉(zhuǎn)錄因子。最后，基于人與鼠的開(kāi)放染色質(zhì)的保守性，作者揭示了部分人類遺傳病與開(kāi)放染色質(zhì)間的潛在關(guān)系，拓展了該研究的意義。
??一個(gè)有趣的問(wèn)題是能否將大量不同組織的單細(xì)胞RNA-seq和單細(xì)胞ATAC-seq整合起來(lái)進(jìn)行比較研究。由于這些數(shù)據(jù)是不同的單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)獲得的，而每個(gè)細(xì)胞的identity在實(shí)驗(yàn)中都是推測(cè)出來(lái)的，而并非完全明確的，因此在技術(shù)上整合兩種數(shù)據(jù)具有很大的挑戰(zhàn)性。作者采用了一種label-transfer的方法，整合RNA-seq和ATAC-seq數(shù)據(jù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行聚類，并將每個(gè)single cell ATAC-seq中的細(xì)胞周圍的single cell RNA-seq細(xì)胞的最常見(jiàn)的label賦予該細(xì)胞。值得一提的是在分析中用到的single cell RNA-seq數(shù)據(jù)之一就是郭國(guó)驥實(shí)驗(yàn)室今年在Cell 發(fā)表的小鼠組織single cell RNA-seq的數(shù)據(jù)。這種label-transfer的分析方法具有探索性，從結(jié)果來(lái)看有合理性的部分，同時(shí)也有明顯的問(wèn)題，比如還缺乏其他獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證等。
??總之，在該項(xiàng)研究中，作者通過(guò) sci-ATAC-seq以及相應(yīng)分析和質(zhì)控方法，獲得了較好的多組織單細(xì)胞層面的開(kāi)放染色質(zhì)信息，為組織結(jié)構(gòu)，發(fā)育和分化，各組織器官的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究提供了豐富的參考。然而，目前相關(guān)技術(shù)仍然有一些缺陷，比如相比single cell RNA-seq，single cell ATAC-seq每個(gè)細(xì)胞的coverage比較低。另外，每種或每類細(xì)胞的identity如何驗(yàn)證？是否有方法能夠有效的在單細(xì)胞水平同時(shí)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)動(dòng)態(tài)調(diào)控。最后，受限于物種差異，以小鼠開(kāi)放染色質(zhì)的數(shù)據(jù)直接分析部分人類遺傳性疾病可能帶有一定局限性。相信這項(xiàng)研究是探索基因如何在單細(xì)胞水平實(shí)現(xiàn)時(shí)空表達(dá)特異性調(diào)控這一激動(dòng)人心的核心生物學(xué)問(wèn)題的剛剛開(kāi)始。
參考材料：
https://shendure-web.gs.washington.edu/current.html
Cusanovich, D. a et al. Epigenetics. Multiplex single-cell profiling of chromatin accessibility by combinatorial cellular indexing. Science 348, 910–4 (2015).
Buenrostro, J. D. et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature 523, 486–490 (2015).
