1. Western Blot原理Westernblot的原理是蛋白質(zhì)在電力場的作用 下，由大到小的進(jìn)行排列，利用電泳進(jìn)行分離和富集。擁有抗原表位的蛋白質(zhì)分子被抗體（一抗）特異性識別并與之結(jié)合。在此基礎(chǔ)上，酶或熒光標(biāo)記的二抗識別并結(jié)合一抗，通過與底物反應(yīng)顯色來觀察目的蛋白。
Westernblot顯色的方法主要有以下幾種：（1）放射自顯影（2）底物化學(xué)發(fā)光ECL（3）底物熒光ECF（4）底物DAB呈色?，F(xiàn)常用的有底物化學(xué)發(fā)光ECL和底物DAB呈色。大部分Westernblot顯色底物是化學(xué)發(fā)光底物，發(fā)表文章通常也是用底物化學(xué)發(fā)光ECL。
2. 目的蛋白信號弱或無
在
Westernblot發(fā)光檢測中常見的問題之一就是目的蛋白信號弱或無。首先考慮是否轉(zhuǎn)膜不充分/過轉(zhuǎn)，如果是，則要優(yōu)化轉(zhuǎn)膜條件；其次，在轉(zhuǎn)膜合適的前提下考慮是否抗體-抗原敏感性過低，也可能是底物HRP或底物活性降低，可以通過加大上樣量/提高抗體濃度/使用敏感底物/延長壓片時(shí)間解決。凝膠太厚，曝光時(shí)間短也會(huì)使蛋白信號降低，因此，要延長轉(zhuǎn)膜時(shí)間和膠片的曝光時(shí)間。
3. 非特異性條帶????? 非特異性條帶與抗體交叉反應(yīng)有關(guān)。單抗比多抗特異性好，純度高，另外適當(dāng)稀釋一抗/二抗?jié)舛?，也是有必要的。如果樣本在處理過程中發(fā)生降解，則樣本處理時(shí)加入蛋白抑制劑在冰上操作。
4. 顯影后膜上條帶處變?yōu)辄S色或白色可能是HRP過高導(dǎo)致的敏感性或背景太高，應(yīng)降低抗體濃度。5. 條帶內(nèi)無顯影的白點(diǎn)
一般是與轉(zhuǎn)膜和顯影的操作有關(guān)，轉(zhuǎn)膜前盡量將膜平衡，并注意膠和膜之間避免氣泡，顯影時(shí)膜與X光片間也應(yīng)避免氣泡。
6.存在散在小圓斑
?牛奶封閉液中的雜質(zhì)顆粒導(dǎo)致，解決此類問題可提前配置好封閉液于4度保存，使用時(shí)勿混勻，僅用上層。
7. Western Blot化學(xué)發(fā)光(ECL)淬滅的原因？
Western Blot“淬滅”的原因主要在兩方面：含HRP的抗體和發(fā)光試劑。由于長期應(yīng)用某種發(fā)光試劑，人們多注意了抗體，不知道發(fā)光試劑其實(shí)也會(huì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成重大影響。對抗體方面來說，可以采用適當(dāng)降低抗體的濃度，發(fā)光實(shí)驗(yàn)時(shí)快速操作來解決“淬滅”的問題；對發(fā)光試劑來說，可以選用發(fā)光穩(wěn)定的發(fā)光試劑來解決“淬滅”的問題。
8. Western Blot背景太高
?????? 背景深是在Western blot發(fā)光檢測中最常見的問題，造成背景深的原因很多。第一，封閉的問題，封閉條件一般為5%牛奶或BAS室溫封閉2-4h，但最好4度過夜；實(shí)際上牛奶對于多數(shù)抗體來說效果不錯(cuò)，但二抗與牛奶可能有交叉反應(yīng)，因此洗滌很重要。另外BSA蛋白單一，可降低因牛奶其他成分引起的背景。第二，TBST洗脫不徹底也會(huì)導(dǎo)致背景深，適當(dāng)增加洗脫時(shí)間、次數(shù)、用量可以減輕背景顏色，有時(shí)候膜沒有完全均勻的浸潤也是原因之一。第三，條帶背景深也與曝光時(shí)間有關(guān)，曝光時(shí)間超過半小時(shí)出現(xiàn)背景是很正常的，所以可以的話建議曝光1-10min。第四，抗體濃度太高也會(huì)導(dǎo)致背景高，建議實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行檢測。
9. Western Blot中Tween-20的作用是什么？應(yīng)該怎么用？
Tween-20是一種非離子型表面活性劑。用途為水包油乳化劑、可用作溶劑、擴(kuò)散劑、穩(wěn)定劑、潤滑劑和抗靜電劑等。氣相色譜固定液(最高使用溫度120℃)分離分析揮發(fā)油、脂肪酸酯、醇、酮和鹵化物。
Westernblot的操作流程中大部分都用到TBST洗液，而且還是封閉，一抗二抗孵育這種比較關(guān)鍵的步驟。通常Tween-20作為一種非離子型表面活性劑，效果和SDS、BSA作用差不多。由于膜上結(jié)合的蛋白會(huì)因?yàn)橐恍┤ノ蹌┒淮?，因此在封閉時(shí)可使用Tween20清除去污劑，而且濃度不要超過0.3%（0.05%效果最好），如果牛奶封閉效果不好可以提高吐溫濃度。
在WB洗液里的吐溫是和BSA一樣，對抗原抗體蛋白提供保護(hù)作用，同時(shí)因?yàn)槭潜砻婊钚詣ㄋ颈P加成親水的環(huán)氧乙烷基團(tuán)后的化合物），可以減少抗體對抗原的非特異性作用，用于洗脫未結(jié)合的抗體、減少非特異性結(jié)合。Tween-20是我們用TBST的時(shí)候Tween-20得用量是0.5ml/L，不加SDS。
10. 出現(xiàn)變形條帶
凝膠存在氣泡或是雜質(zhì)、電流不穩(wěn)定、凝膠冷切不均勻。制膠器具和電泳槽保持干凈，換新的電解液，保證材料無污染，制膠過程中清除氣泡。如電泳槽老化建議換新。盡量選擇中間孔加入樣品，避免兩端上樣。?
