使用Cellranger vdj 流程能得到一個網(wǎng)頁版的報告，如上圖樣式.
今天將對這幾個指標(biāo)進行解釋說明,用于后續(xù)troubleshooting。
問題：在10X V(D)J 數(shù)據(jù)中使用哪些指標(biāo)來troubleshooting?
V(D)J網(wǎng)頁報告提供了一些關(guān)鍵的指標(biāo)，能夠幫助排除V(D)J實驗中的某些問題，由于GEX和V(D)J數(shù)據(jù)集之間的細胞富集差而產(chǎn)生?？梢詭椭鉀Q這類問題。
指標(biāo)1 ：Estimated number of cells
描述和限制：
細胞數(shù)量，barcode的數(shù)量估計與表達靶向V(D)J轉(zhuǎn)錄本的細胞有關(guān)。這個值取決于預(yù)期的T/B細胞數(shù)量。
失敗的原因：
V(D)J細胞數(shù)量低于或高于預(yù)期可能是由于樣本質(zhì)量差、文庫質(zhì)量差或測序質(zhì)量差。
如果細胞數(shù)量過高，建議cellranger multi刪除背景*。
如果細胞數(shù)量過低，考慮查看
Reads mapped to any V(D)J gene的值(如下)，并聯(lián)系10x Genomics技術(shù)支持，獲得文庫富集溯源。
指標(biāo)2 ：Reads mapped to any V(D)J gene
描述和限制：
部分或全部read比對到V(D)J基因片段的比例。
- Ideal > 50% ; > 40% is an acceptable limit.
失敗的原因：
這可能與樣本中B細胞或T細胞的比例有關(guān)。低比例的樣本可能只有有限數(shù)量的B細胞或T細胞。這些樣品可能需要富集，請參考這篇文章中的方法。
- 在一些其他的情況下，這可能是由于化學(xué)試劑用錯或reference使用錯誤。
指標(biāo)3 ：Cells with productive V(D)J spanning pair
描述和限制：
被稱為是細胞的barcode的比例，每個受體對至少有一個鏈?zhǔn)莗roductive contig（參考引申問題）。
- Ideal > 30% ; >20% is an acceptable limit
【引申問題】什么是productive contig呢？
使用cellranger vdj在contig_annotations.csv（或者filtered_contig_annotations.csv）結(jié)果中會有一列：Productive，
一個 productive contig必須滿足下列條件：
是跨過了V到J的區(qū)域，起始密碼子在leader region。
是否有一個帶有起始密碼子的可檢測的CDR3區(qū)域
在V-J跨越區(qū)域中沒有停止密碼子。
失敗的原因：
較低的值可能表明樣品質(zhì)量較差，富集較差或低，覆蓋較差或測序深度較低。捕獲或表達單鏈可能有如下幾個原因（參考引申問題）。
- 在極少數(shù)情況下，也有可能是化學(xué)試劑用錯導(dǎo)致值低。
【引申問題】：為什么有些clonotype只有1個productive 鏈呢？
每個細胞都有一個TRA和TRB鏈，為什么有些clonotype只有1個productive 鏈呢？回答：Cell Ranger 流程沒有過濾掉只有1條鏈的contig。有很多原因：
沒有檢測到mRNA轉(zhuǎn)錄本: 缺失鏈的mRNA轉(zhuǎn)錄本可能已經(jīng)存在于細胞中，但沒有被檢測到。對于低表達的轉(zhuǎn)錄本尤其如此。
沒有contig組裝: 一些被檢測到的轉(zhuǎn)錄本可能無法組裝成contig。
未被標(biāo)記為有效: 一些組裝的contigs可能無法被標(biāo)記為有效contig。過濾后的結(jié)果中只顯示productive鏈。在all_contig_annotations.csv文件中能查找未被標(biāo)記為有效的contig。
在極少數(shù)情況下，細胞可能只表達一條鏈。
指標(biāo)4 ：Median UMIs per cell for V(D)J gene
描述和限制：
每個細胞中分配給VDJ 基因{每條鏈}的contig的UMI數(shù)的中位數(shù)(鏈?zhǔn)侵窽RA/TRB或IGH/IGK/IGL)。
- Ideal >0 UMIs
失敗的原因：
中位數(shù)越高，表明對該鏈表達的支持越高。
中位數(shù)為0的UMI往往表明TCR/BCR鏈表達較差，樣品質(zhì)量較差，或在某些情況下富集較差/低。在極少數(shù)情況下，缺失的鏈可能反映了樣本的生物學(xué)特性。
盡管表達水平與細胞類型有關(guān)，但通常情況下TRA轉(zhuǎn)錄本的表達水平要低于TRB轉(zhuǎn)錄本。如果有GEX數(shù)據(jù)，可以使用Loupe文件來識別T/B細胞的表達，步驟參考這里。
指標(biāo)5：Barcode Rank plot
描述和限制：
根據(jù)實驗，評估觀察到的barcode被稱為細胞的比例和每個條形碼的UMI計數(shù)范圍。
Y軸是UMI 數(shù)，是在x軸上映射到每個barcode的過濾過的UMI數(shù)。圖的顏色基于與細胞相關(guān)的barcode的局部密度。
失敗的原因：
在rank plot中出現(xiàn)的凸起可以表明一組高表達的細胞類型。例如，在Ig數(shù)據(jù)的web_summary中，漿細胞可以導(dǎo)致這種表型。
在下面的另一個例子中，V(D)J庫中的細胞太少了，我們可以看到藍色的線尾隨到UMI很低的barcode中。
指標(biāo)6：Valid Barcodes
描述和限制：
barcode校正后與白名單匹配的reads的比例。
Ideal > 85%
Acceptable is >75%
失敗的原因：
如果這項出現(xiàn)有效barcode低的警告，可能發(fā)生以下幾種原因:
通常與樣品質(zhì)量差、測序質(zhì)量差或測序參數(shù)不當(dāng)有關(guān)。
在極少數(shù)情況下，這一警告可能是由于SPRI清洗過程中乙醇洗滌液去除不完全，可能導(dǎo)致不需要的產(chǎn)品放大，有時會導(dǎo)致有效barcode降低。請參考這篇文章。
指標(biāo)7：Top clonotype histogram
描述和限制：
histogram顯示了樣本中10個豐度最高的克隆型所占的細胞比例。在好的樣本中，大多數(shù)克隆型會同時擁有兩條鏈。
失敗的原因：
如果注意到一個多鏈的大克隆型部分，這是極有可能是ambient RNA（*下文解釋）。Cell Ranger v5及以上版本實現(xiàn)了一種更好的克隆類型分組算法。在多個克隆型中存在相同的鏈也表示為 ambient RNA。
*其他注意事項:10X的算法試圖過濾掉含有ambient RNA的乳細胞受到壓力或有一些鏈泄漏的barcode。如果有GEX文庫，這可以從高表達的核糖體(RPS/RPL)、線粒體(MT-/)和MALAT1基因(死亡和死亡細胞的關(guān)鍵特征)中確定。如果適用，請參閱關(guān)于死細胞去除方案的技術(shù)說明。
