1. 首先使用野生型小鼠來尋找左心室與腦連接的區(qū)域

1.動物模型準備：

使用野生型（WT）小鼠。

2.病毒工具：

使用逆行型腺相關(guān)病毒（AAV2/retro-CAG-TdTomato）作為示蹤工具，具備逆行追蹤能力，可被神經(jīng)末梢攝取并向上傳輸至胞體。

3.注射方式：

利用無創(chuàng)超聲引導(dǎo)技術(shù)，將病毒精確注射至小鼠的左心室（LV）壁，以確保病毒傳入心臟神經(jīng)末梢處。

4.病毒逆行追蹤：

病毒在心臟神經(jīng)末梢被攝取后，逆行運輸至神經(jīng)元胞體，追蹤心臟—中樞神經(jīng)系統(tǒng)的投射路徑。

5.組織取材與成像分析：

解剖并分析以下區(qū)域：

結(jié)節(jié)神經(jīng)節(jié)（nodose ganglion）：

可見逆行標記的神經(jīng)元胞體（表達TdTomato）。它是迷走神經(jīng)的第一感覺中繼站。

其神經(jīng)元將外周器官的感覺信號（如心臟壓力、血管擴張、腸道牽張）傳入腦干中的孤束核（NTS）。是聯(lián)系自主神經(jīng)系統(tǒng)與外周內(nèi)臟的關(guān)鍵橋梁。

腦干孤束核（NTS）及極后區(qū)（AP）：

發(fā)現(xiàn)有 TdTomato 表達的神經(jīng)纖維，提示結(jié)節(jié)神經(jīng)元將LV連接至這些大腦區(qū)域。

“WT是地圖，疾病是干擾”——要先用WT畫清楚基礎(chǔ)神經(jīng)通路地圖，再用疾病模型疊加上去看哪些區(qū)域出現(xiàn)病理性過度激活，這樣結(jié)果才更可信、機制才更清晰。

術(shù)后1天就測Fos
為了研究整合迷走神經(jīng)傳入神經(jīng)的神經(jīng)元的功能相關(guān)性，我們分析了 FOS 表達——神經(jīng)元激活的強大標志物——在接受 TAC 1 天的小鼠背側(cè)迷走神經(jīng)復(fù)合體中，并伴有假對照

2.?建立心-腦-脾神經(jīng)反射模型：

① 動物模型：野生型（WT）小鼠。腦-脾? ?TAC → 激活迷走神經(jīng)傳入 → 腦干（NTS）整合 → 輸出迷走神經(jīng)信號 →→ 作用于腹腔神經(jīng)節(jié) → 激活脾交感神經(jīng) → SSNA升高

模型操作：

TAC（主動脈縮窄術(shù)）→ 建立左心室（LV）壓力超負荷。

假手術(shù)為對照組。

② 記錄神經(jīng)活動：

神經(jīng)放電記錄：

測量術(shù)后1天的：

腹腔迷走神經(jīng)活動（CVNA）

脾交感神經(jīng)活動（SSNA）

比較 TAC 與假手術(shù)小鼠。

干預(yù)驗證：

乳糜瀉迷走神經(jīng)切斷術(shù)（subdiaphragmatic vagotomy）：

檢測其是否可抑制TAC誘導(dǎo)的SSNA升高 → 證明該通路依賴迷走神經(jīng)。

③ 干預(yù)遠端交感通路以驗證功能： 做下游或者說是遠端

腹腔神經(jīng)節(jié)切除（CGX）：

切除脾臟的交感神經(jīng)輸入來源，驗證脾神經(jīng)是否參與心臟重塑。

檢測：

脾酪氨酸羥化酶（TH）表達減少（去神經(jīng)效果驗證）-脾臟對神經(jīng)的反應(yīng)指標

心臟巨噬細胞數(shù)目（流式）

心臟重塑程度（超聲EF、RWT等）

時效性驗證：

在TAC后第二周再行 CGX（適應(yīng)性重塑已發(fā)生）→ 發(fā)現(xiàn)此時 CGX 無法逆轉(zhuǎn)心臟重塑，說明其作用僅在早期階段關(guān)鍵。

四、驗證局部交感神經(jīng)對心臟重塑的作用：

頸上神經(jīng)節(jié)切除（CerGX）：

去除心臟局部交感神經(jīng)輸入。

檢測：

LV交感神經(jīng)標記缺失（TH染色）

心臟巨噬細胞數(shù)量和心臟重塑變化（無明顯影響）。

五、排除血流動力學(xué)干擾因素：

測量血流動力學(xué)參數(shù)（超聲和多普勒）：

驗證 CGX 和 CerGX 不影響 TAC 后產(chǎn)生的壓力梯度，排除影響心臟負荷程度的可能。

?1. 腦到脾臟：走副交感迷走神經(jīng)

迷走神經(jīng)（Vagus Nerve）是副交感神經(jīng)系統(tǒng)的主要組成部分，它：

從腦干出發(fā)，延伸至胸腹腔；

支配脾臟、腸道、肝臟等內(nèi)臟；

在腦-脾通路中，迷走神經(jīng)控制的是**“反炎性通路”**（例如釋放乙酰膽堿，抑制脾巨噬細胞釋放TNF-α等炎癥因子）。

????（迷走神經(jīng)）?? 脾臟

即：“炎癥調(diào)控指令”來自腦部，通過迷走神經(jīng)傳入脾臟。

?2. 脾臟到心臟：走交感神經(jīng)

交感神經(jīng)系統(tǒng)控制“應(yīng)激”或“戰(zhàn)斗-逃跑”反應(yīng)：

交感神經(jīng)來自脊髓→交感鏈→目標器官；

脾臟的交感神經(jīng)主要來自腹腔神經(jīng)節(jié)（celiac ganglion）；

心臟的交感神經(jīng)則來自頸上交感神經(jīng)節(jié)（e.g., superior cervical ganglion）。3.? 建立心-腦-脾神經(jīng)反射模型：

3. 脾臟切除證明脾臟對TAC小鼠心臟功能及巨噬細胞擴張是有促進作用的

4. 明確脾臟作用于心臟的方式和分子-確定是脾臟通過分泌蛋白發(fā)揮的心臟巨噬細胞增殖調(diào)控作用

心臟巨噬細胞的擴增障礙是由于脾臟對心臟輸送的免疫細胞減少還是由于對心臟巨噬細胞的分泌調(diào)控作用？

所以后面作者使用了兩種基因鼠，包括用Nr4a1?/? 和 Ccr2?/? 小鼠。排除了Ly6Chi單核細胞來源的促炎通路參與巨噬細胞擴張，推測脾臟是通過旁分泌方式（而非動員單核細胞）介導(dǎo)心臟巨噬細胞擴張的。然后作者猜想是否是原位巨噬細胞RM（Timd4?、Ly6C?）是否在心臟應(yīng)激下通過自身擴增來支持心臟的適應(yīng)性？使用的是原位巨噬細胞敲除的小鼠。后面又用了Timd4?Lyve1?Ly6C?作為心臟 RM 的代表來具體檢測是否影響了心臟原位巨噬細胞的增殖。壓力超負荷（TAC）會驅(qū)動心臟 RM 的局部增殖，而不僅僅依賴單核細胞募集，從而支持心臟對血流動力學(xué)負荷的適應(yīng)性重塑。

心臟應(yīng)激（TAC）→ 正常情況下 RM（Cx3cr1?）增殖 → 促進適應(yīng)性心肌肥厚 → 阻止 LV 擴張和 HF

但在 Cx3cr1?/??小鼠中，RM 無法擴增 → 適應(yīng)失敗 → 快速發(fā)展為 HF

? 為什么心臟巨噬細胞擴張失敗會導(dǎo)致心力衰竭？

在壓力超負荷（如TAC）早期，心臟需要適應(yīng)性重塑來應(yīng)對不斷增強的機械應(yīng)力。如果在這一階段：

巨噬細胞不能擴張，或擴張的巨噬細胞功能異常，

就會導(dǎo)致：心肌細胞應(yīng)激無法被緩解，毛細血管重構(gòu)失敗，炎癥清除延遲，纖維化反應(yīng)紊亂，最終導(dǎo)致適應(yīng)性重塑向病理性重塑轉(zhuǎn)變，進展為心力衰竭。研究發(fā)現(xiàn)，這一階段擴張的巨噬細胞主要是抗炎、修復(fù)型巨噬細胞，它們通過以下方式發(fā)揮保護作用：清除死亡細胞（胞葬）分泌抗炎因子如IL-10、TGF-β促進成纖維細胞和血管細胞有序激活調(diào)控心肌細胞代謝與應(yīng)激反應(yīng)。

??已有文獻和前期工作提示：

PlGF在其他高血壓模型中（如Ang II刺激）已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)與心血管重塑相關(guān)。

作者自己曾報道過Pgf?/?小鼠對壓力超負荷表現(xiàn)出不良重塑（reference 14），這是一個強有力的前提線索。

另有研究表明交感神經(jīng)通路能促進脾臟分泌PlGF（reference 24），提示PlGF可能是脾臟介導(dǎo)心臟-免疫對話的關(guān)鍵信號分子。

1. 觀察現(xiàn)象（前期基礎(chǔ)）

Pgf?/?小鼠在 TAC 后表現(xiàn)為心臟不良重塑 → 說明 PlGF 可能是正向調(diào)控因子。

2. 分析 TAC 后 PlGF 的動態(tài)表達

TAC 會誘導(dǎo)脾臟中 PlGF 表達迅速上升，1 周后恢復(fù)基線；

血漿中 PlGF 水平也隨之升高 → 表明 PlGF 在系統(tǒng)水平被釋放，可能影響遠處器官如心臟。

3. 分析 PlGF 缺失對心臟免疫反應(yīng)的影響

Pgf?/?小鼠在 TAC 后無法擴增心臟巨噬細胞（特別是 Timd4?Ly6C^low resident macrophages, RM）；

且這些 RM 的增殖能力也顯著受損→ 提示 PlGF 是其擴增的關(guān)鍵因子。

4. 明確 PlGF 來源于脾臟

組織學(xué)顯示 PlGF 在 TAC 后位于ERTR7?網(wǎng)狀細胞界定的脾臟邊緣區(qū)；

該區(qū)由 TH?交感神經(jīng)纖維支配 → 暗示神經(jīng)-免疫調(diào)控機制。

5. 驗證交感神經(jīng)依賴性

交感去神經(jīng)（CGX）后小鼠：

脾臟 PlGF 表達不再上升；

循環(huán) PlGF 水平也無升高；

心臟 RM 不再增殖；

→ 證實交感神經(jīng)控制脾 PlGF 分泌，進而影響心臟免疫狀態(tài)。

6. 功能性驗證：脾移植模型

將PlGF 缺失脾臟移植至 WT 小鼠→ 無法改善 TAC 誘導(dǎo)的心功能障礙；

將WT 脾臟移植至 PlGF 缺失小鼠→ 心功能恢復(fù)；→ 說明PlGF 的脾源性是介導(dǎo)適應(yīng)性重塑的關(guān)鍵。

7. 替代補救驗證：rPlGF 治療

TAC + 脾切除的小鼠 → 會發(fā)展為 HF；

注射重組 PlGF（rPlGF） → 可拯救其心功能，增強 RM 增殖；→ 證明PlGF 作為遠端細胞因子作用于心臟，具有功能可替代性

5. 單細胞數(shù)據(jù)驗證心臟中確實是原位的巨噬細胞表達最多的PlGF受體

6. 受體敲除?Nrp1-floxed?（Nrp1FL/FL） 與?Lyz2-cre?小鼠

7.壓力超負荷 ? 脾源PlGF分泌 ? 激活NRP1? RM ? 分泌IGF-1 ? 心肌適應(yīng)性重塑-找到具體分泌的東西是什么

8. NRP1? RM擴增（分化為增殖型RM / IGF-1? RM / CD206?纖維化RM）-也確定了另一個表型即膠原沉積的巨噬細胞類型