DPP7調(diào)控結(jié)直腸癌腫瘤相關(guān)巨噬細胞功能的研究解讀

一、文章信息

• 發(fā)表雜志名稱：International Journal of Biological Sciences

• 中文標題：DPP7促進結(jié)直腸癌腫瘤相關(guān)巨噬細胞的脂肪酸β-氧化并塑造免疫抑制微環(huán)境

• 英文標題：DPP7 promotes fatty acid β-oxidation in tumor- associated macrophages and determines immunosuppressive microenvironment in colorectal cancer

• 影響因子：10

• 發(fā)表日期：2025年10月01日

二、研究概述

結(jié)直腸癌（CRC）中，腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAMs）是免疫抑制性腫瘤免疫微環(huán)境（TIME）的關(guān)鍵調(diào)控者，但目前仍缺乏明確的TAMs功能調(diào)控基因作為免疫治療靶點。本研究通過單細胞RNA測序（scRNA-seq）篩選出TAMs中高表達的關(guān)鍵基因二肽基肽酶VII（DPP7），發(fā)現(xiàn)DPP7?TAMs與CRC患者轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后密切相關(guān)。功能上，DPP7?TAMs呈現(xiàn)M2極化表型，通過誘導(dǎo)CD8?T細胞耗竭構(gòu)建免疫抑制微環(huán)境。機制上，DPP7與肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1A（CPT1A）結(jié)合，競爭性抑制TRIM25介導(dǎo)的CPT1A泛素化降解，增強TAMs的脂肪酸氧化（FAO），促進能量代謝重編程。體內(nèi)實驗證實，敲低骨髓來源巨噬細胞（BMDMs）中的DPP7可協(xié)同抗PD-1治療，逆轉(zhuǎn)免疫抑制微環(huán)境，顯著抑制CRC皮下移植瘤生長及肝轉(zhuǎn)移。該研究首次揭示DPP7作為TAMs代謝重編程的核心調(diào)控因子，為CRC免疫治療提供了新的潛在靶點。

三、研究目標與解決的實際問題

1. 研究目標

• 篩選結(jié)直腸癌（CRC）中腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAMs）的關(guān)鍵功能基因，明確其臨床預(yù)后價值；

• 闡明該基因調(diào)控TAMs表型及功能的分子機制，尤其是代謝重編程相關(guān)通路；

• 驗證靶向該基因聯(lián)合免疫檢查點抑制劑（如抗PD-1）治療CRC的可行性及協(xié)同效應(yīng)。

2. 解決的實際問題

• 破解CRC免疫治療響應(yīng)率低的困境：CRC多為“冷腫瘤”，僅15% mismatch repair-deficient/microsatellite instability-high（dMMR/MSI-H）亞型對免疫檢查點抑制劑（ICI）有持久響應(yīng)，且50%轉(zhuǎn)移性患者會產(chǎn)生獲得性耐藥，本研究識別出TAMs中驅(qū)動免疫抑制的關(guān)鍵基因，為改善免疫治療效果提供新靶點；

• 克服TAM靶向治療的局限性：現(xiàn)有TAM靶向策略（耗竭、抑制招募、重編程）存在非特異性或代償性耐藥風(fēng)險，本研究發(fā)現(xiàn)的DPP7-CPT1A-TRIM25調(diào)控軸為精準靶向TAMs代謝重編程提供新思路；

• 明確CRC不良預(yù)后的生物標志物：DPP7?TAMs浸潤密度可作為CRC患者獨立預(yù)后指標，為臨床預(yù)后評估提供新工具。

四、研究方法及目的（表格形式）

表1：生信分析方法及目的

表2：臨床樣本驗證方法及目的

表3：細胞實驗方法及目的

表4：動物實驗方法及目的

五、實驗設(shè)計與結(jié)果邏輯解讀
1. Figure 1：TAMs中預(yù)后相關(guān)標志物的篩選

• 設(shè)計邏輯：CRC的TIME中TAMs功能關(guān)鍵但調(diào)控基因不明，需通過單細胞測序篩選特異性標志物。首先解析CRC組織單細胞轉(zhuǎn)錄組，聚焦巨噬細胞與預(yù)后相關(guān)的差異基因，通過交集分析和LASSO回歸篩選核心靶點。

• 實驗/分析設(shè)計：

1. 分析GSE178341數(shù)據(jù)集（64例CRC、36例正常組織，26617個細胞），通過t-SNE聚類得到12種細胞亞群，重點分析巨噬細胞的差異表達基因；

2. 整合3個基因集：scRNA-seq鑒定的TAMs標志物、腫瘤vs正常組織巨噬細胞中上調(diào)基因、TCGA隊列中預(yù)后不良相關(guān)基因；

3. 經(jīng)LASSO回歸篩選出8個候選基因，以DPP7的回歸系數(shù)最高，且在巨噬細胞中高表達。

• 結(jié)果：

1. 巨噬細胞在腫瘤組織中富集吞噬作用、代謝調(diào)控、抗原呈遞相關(guān)通路（Figure 1C），提示其功能發(fā)生顯著重塑；

2. DPP7在巨噬細胞中高表達，在其他免疫細胞和實質(zhì)細胞中低表達（Figure 1G、H），且CRC組織中DPP7表達顯著高于正常組織；

3. 確定DPP7為TAMs中核心候選基因，可能參與CRC預(yù)后調(diào)控。

   
   

2. Figure 2：DPP7?TAMs的臨床預(yù)后價值驗證

• 設(shè)計邏輯：篩選出DPP7后，需明確其在臨床樣本中的表達定位及與患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)，驗證其作為生物標志物的潛力。

• 實驗/分析設(shè)計：

1. 對華東醫(yī)院282例CRC患者樣本進行IF雙染色（DPP7+CD68），定義DPP7?TAMs；

2. 量化DPP7?TAMs在腫瘤vs正常組織、轉(zhuǎn)移vs非轉(zhuǎn)移樣本中的浸潤密度；

3. 結(jié)合IHC結(jié)果及TCGA隊列數(shù)據(jù)，進行Kaplan-Meier生存分析和多因素Cox回歸。

• 結(jié)果：

1. DPP7與CD68在腫瘤組織中存在共定位（Figure 2A），DPP7?TAMs在腫瘤組織中浸潤密度顯著高于正常組織（Figure 2B），且轉(zhuǎn)移患者中更高（Figure 2D）；

2. 高DPP7?TAMs浸潤的CRC患者總生存期（OS）顯著縮短（Figure 2H），且DPP7與CD68共高表達患者預(yù)后最差（Figure 2J、M）；

3. 多因素Cox回歸證實，DPP7?TAMs浸潤密度是CRC患者OS的獨立預(yù)后因素（Table 1）。

   
   

3. Figure 3：DPP7?TAMs對免疫抑制微環(huán)境的調(diào)控作用

• 設(shè)計邏輯：明確DPP7?TAMs的臨床價值后，需進一步探索其對TIME的影響，尤其是對免疫細胞亞群及功能的調(diào)控。

• 實驗/分析設(shè)計：

1. 對8例新鮮CRC樣本進行CyTOF分析，解析DPP7?TAMs高/低浸潤組的免疫細胞組成差異；

2. 通過mIF檢測DPP7?TAMs與CD8?T細胞、PD-1的共定位關(guān)系；

3. 分析CD8?T細胞功能標志物（PD-1、TIM3、CTLA4等）的表達水平。

• 結(jié)果：

1. CyTOF聚類顯示DPP7主要表達于TAMs（Figure 3A、B），高DPP7?TAMs組中CD8?T細胞、調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）、髓系來源抑制細胞（MDSCs）浸潤顯著增加（Figure 3D）；

2. 高DPP7?TAMs組中CD8?T細胞的耗竭標志物PD-1表達顯著升高（Figure 3E、F）；

3. mIF結(jié)果證實DPP7?TAMs浸潤與PD-1?CD8?T細胞比例呈正相關(guān)（Figure 3G、H），提示DPP7?TAMs促進免疫抑制微環(huán)境形成。

• 設(shè)計邏輯：基于Figure 3的相關(guān)性分析，需通過體外共培養(yǎng)和體內(nèi)動物實驗驗證DPP7?TAMs對CD8?T細胞功能的直接調(diào)控作用。

• 實驗/分析設(shè)計：

1. 體外構(gòu)建TAM樣BMDMs（經(jīng)MC38細胞TCM誘導(dǎo)），構(gòu)建DPP7敲低（shDPP7）和對照（shNC）細胞系；

2. 將TAM樣BMDMs與CD8?T細胞共培養(yǎng)，檢測CD8?T細胞的PD-1表達及細胞毒性標志物（GZMB、IFN-γ）水平；

3. 構(gòu)建皮下移植瘤模型（C57BL/6J免疫competent小鼠和BALB/c-nu免疫缺陷小鼠），驗證DPP7敲低對腫瘤生長的影響及CD8?T細胞的作用。

• 結(jié)果：

1. 體外共培養(yǎng)中，shDPP7-BMDMs組CD8?T細胞PD-1表達降低，GZMB和IFN-γ表達升高（Figure 4D-F）；

2. 體內(nèi)實驗中，shDPP7-BMDMs可顯著抑制C57BL/6J小鼠腫瘤生長（Figure 4H），但對BALB/c-nu小鼠無顯著作用（Figure 4I）；

3. 敲低DPP7不影響CD8?T細胞浸潤效率，但顯著降低其PD-1表達（Figure 4J、K），且CD8?T細胞耗竭后shDPP7的抗腫瘤作用消失（Figure 4L），證實DPP7?TAMs通過誘導(dǎo)CD8?T細胞耗竭促進腫瘤進展。

• 設(shè)計邏輯：明確DPP7?TAMs的功能后，需探索其分子機制，聚焦代謝重編程（已知M2型TAMs依賴FAO供能）。

• 實驗/分析設(shè)計：

1. 對DPP7過表達的THP-1巨噬細胞進行RNA-seq，分析差異表達基因及富集通路；

2. 通過LC-MS/MS鑒定DPP7相互作用蛋白，結(jié)合代謝組學(xué)分析脂質(zhì)代謝變化；

3. 檢測TG、FFA含量、ATP生成及氧消耗率（OCR），評估FAO活性；

4. 檢測M1/M2表型標志物（CD80、CD206、TLR2/4、VEGFA等）的表達。

• 結(jié)果：

1. RNA-seq及功能富集分析顯示，DPP7過表達顯著富集脂肪酸代謝、FAO相關(guān)通路（Figure 5B、C）；

2. DPP7過表達誘導(dǎo)TAMs呈現(xiàn)M2表型：M1標志物（TLR2/4、CXCL9/10）下調(diào)，M2標志物（CD206、VEGFA、IL10）上調(diào)（Figure 5D、E）；

3. 代謝檢測顯示，DPP7過表達組TG、FFA含量降低，ATP生成增加，OCR升高（Figure 5I-L），證實DPP7促進TAMs的FAO活性。

   
   

6. Figure 6：DPP7通過結(jié)合CPT1A減少其泛素化降解增強FAO

• 設(shè)計邏輯：FAO的關(guān)鍵限速酶為CPT1A，需驗證DPP7是否通過調(diào)控CPT1A功能影響FAO。

• 實驗/分析設(shè)計：

1. 通過Co-IP、Pull-down及免疫熒光共定位驗證DPP7與CPT1A的相互作用；

2. 利用CHX追蹤實驗檢測CPT1A蛋白穩(wěn)定性，MG132（蛋白酶體抑制劑）、氯喹（自噬抑制劑）明確降解途徑；

3. 通過泛素化實驗檢測DPP7對CPT1A泛素化水平的影響；

4. 利用CPT1A抑制劑（Etomoxir）或過表達CPT1A，驗證其在DPP7調(diào)控FAO及M2表型中的作用。

• 結(jié)果：

1. DPP7與CPT1A存在直接相互作用且共定位（Figure 6B-D），DPP7過表達可增加CPT1A蛋白水平但不影響mRNA水平（Figure 6E）；

2. CHX實驗顯示DPP7過表達延緩CPT1A降解，MG132可阻斷該降解（Figure 6F、G），且DPP7過表達顯著降低CPT1A泛素化水平（Figure 6H）；

3. Etomoxir可逆轉(zhuǎn)DPP7過表達誘導(dǎo)的FAO增強、ATP生成增加及M2表型（Figure 6I、K-N），而CPT1A過表達可挽救DPP7敲低的表型（Figure 6J、K-N），證實DPP7通過穩(wěn)定CPT1A促進FAO。

   
   

7. Figure 7：DPP7與TRIM25競爭性結(jié)合CPT1A抑制其泛素化

• 設(shè)計邏輯：明確DPP7穩(wěn)定CPT1A后，需鑒定CPT1A的泛素連接酶，闡明DPP7的調(diào)控方式。

• 實驗/分析設(shè)計：

1. 通過LC-MS/MS鑒定CPT1A相互作用蛋白，結(jié)合UbiBrowser預(yù)測E3泛素連接酶，篩選TRIM25；

2. 驗證TRIM25與CPT1A的相互作用及對CPT1A泛素化、降解的影響；

3. 檢測DPP7對TRIM25-CPT1A結(jié)合的影響，明確競爭性結(jié)合關(guān)系。

• 結(jié)果：

1. TRIM25與CPT1A存在相互作用（Figure 7B-D），TRIM25過表達促進CPT1A泛素化及降解（Figure 7F、H），敲低TRIM25則相反（Figure 7E）；

2. DPP7與TRIM25無直接相互作用，但DPP7過表達可顯著抑制TRIM25與CPT1A的結(jié)合（Figure 7I），且呈濃度依賴性（Figure 7J）；

3. 證實DPP7通過競爭性結(jié)合CPT1A，阻斷TRIM25介導(dǎo)的泛素化降解，穩(wěn)定CPT1A蛋白。

   
   

8. Figure 8：DPP7敲低協(xié)同抗PD-1治療改善CRC療效

• 設(shè)計邏輯：基于上述機制，需驗證靶向DPP7聯(lián)合免疫治療的臨床潛力。

• 實驗/分析設(shè)計：

1. 構(gòu)建CRC皮下移植瘤及肝轉(zhuǎn)移模型，分組為：shNC-BMDMs+IgG、shDPP7-BMDMs+IgG、shNC-BMDMs+抗PD-1、shDPP7-BMDMs+抗PD-1；

2. 檢測各組腫瘤生長、轉(zhuǎn)移負荷及TIME的變化（TAMs表型、CD8?T細胞浸潤及耗竭狀態(tài)）；

3. 分析PD-L1表達水平，探索協(xié)同機制。

• 結(jié)果：

1. 聯(lián)合治療組（shDPP7-BMDMs+抗PD-1）對皮下移植瘤生長（Figure 8B）及肝轉(zhuǎn)移（Figure 8C）的抑制效果最顯著；

2. 聯(lián)合治療組TAMs呈現(xiàn)M1樣表型：MHC-II、CD80表達升高，CD206表達降低（Figure 8D、E）；

3. 聯(lián)合治療組腫瘤浸潤CD8?T細胞數(shù)量增加，PD-1?CD8?T細胞比例降低（Figure 8F、G），且PD-L1表達升高（Supplementary Fig.9），提示DPP7敲低通過重塑TIME增強抗PD-1治療敏感性。

• 核心邏輯總結(jié)：TAMs中DPP7與CPT1A競爭性結(jié)合，阻斷TRIM25介導(dǎo)的CPT1A泛素化降解，增強FAO活性，促進TAMs向M2極化；M2型TAMs通過招募Tregs、MDSCs及誘導(dǎo)CD8?T細胞耗竭構(gòu)建免疫抑制微環(huán)境，促進CRC進展；靶向DPP7可逆轉(zhuǎn)該過程，協(xié)同抗PD-1治療發(fā)揮抗腫瘤作用（Figure 9）。

六、研究總結(jié)

本研究通過多組學(xué)分析、臨床樣本驗證及體內(nèi)外實驗，系統(tǒng)闡明了DPP7在CRC腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAMs）中的功能及調(diào)控機制。首先，通過單細胞RNA測序篩選出TAMs中高表達的關(guān)鍵基因DPP7，證實DPP7?TAMs在CRC組織中高浸潤，且與患者轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后密切相關(guān)，可作為獨立預(yù)后生物標志物。其次，功能實驗表明DPP7?TAMs通過誘導(dǎo)CD8?T細胞耗竭、招募免疫抑制細胞構(gòu)建免疫抑制性腫瘤微環(huán)境（TIME）。機制上，首次發(fā)現(xiàn)DPP7與FAO關(guān)鍵酶CPT1A直接結(jié)合，競爭性抑制E3泛素連接酶TRIM25介導(dǎo)的CPT1A泛素化降解，增強TAMs的FAO代謝重編程，驅(qū)動M2極化。最后，體內(nèi)實驗驗證敲低DPP7可顯著逆轉(zhuǎn)免疫抑制微環(huán)境，與抗PD-1治療產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，抑制CRC生長及轉(zhuǎn)移。該研究不僅揭示了DPP7-CPT1A-TRIM25調(diào)控軸在TAMs代謝重編程中的核心作用，還為CRC的免疫治療提供了新的靶點及聯(lián)合治療策略，具有重要的臨床轉(zhuǎn)化價值。