當我們做到熒光定量實驗時候，普遍采用操作簡便的2–ΔΔCT 法。
前提條件：
1. 使用2–ΔΔCT 法之前，必須驗證目標基因和參照基因的擴增效率。目標基因和參照基因擴增效率都接近100%， 且相互間效率偏差在5% 以內。
計算方法：
首先，對所有的測試樣和校準樣本，用內參基因的CT 值歸一目標基因的CT 值：
ΔCT(test) = CT(target, test) – CT(ref, test)
ΔCT(calibrator) = CT(target, calibrator) – CT(ref, calibrator)
其次，用校準樣本的ΔCT 值歸一試驗樣本的ΔCT 值：
ΔΔCT = ΔCT(test) – ΔCT(calibrator)
最后，計算表達水平比率：
2–ΔΔCT = 表達量的比值
計算模板建立
而現(xiàn)在我們現(xiàn)在用的這款儀器QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System是無法計算的，所以需要自己手動計算，理解原理更容易操作。當然，此公式適合于所有2–ΔΔCT 法的熒光定量。
經(jīng)我修改后計算模板：
Quantitative PCR calculation template for QuantStudio(TM) 7 Flex System_J.F.XIE(均值法) .xls
https://pan.baidu.com/s/1qiubuZxm0y_3F6VYP0obJg
Extract code：hybr
案例展示
以吉瑪生物公司試劑說明書案例為例，來計算 microRNA 相對于 U6 snRNA 的表達比率。
運用計算模板，只需對應輸入數(shù)據(jù)，即可自動計算出公式，結果如下：
值得注意幾點：
1. 數(shù)據(jù)修正：三個重復，如果CT值差異在0.2以外，則應剔除掉，所得結果均值會更加好。
2. 數(shù)據(jù)錄入：我們在做PCR時候，已經(jīng)排好版面，所以再挑出這些基因及內參時候，需要花費精力。簡單點，可以將結果復制粘貼到新的excle文檔，然后“篩選”，依次篩選出不同模板的“內參”、“靶標基因”的CT值，如下圖篩選出的是EGFP對照處理組內參rpl32的CT值。
3. 對應：做定量時候，同一模板做基因，又檢測內參，所以關系是一一對應，所以在錄入時候，一定要對應準確，每個孔都有Well Position，結合著384孔板來看，強烈建議在做排版設計之初，就做到簡潔、對稱、明了，便于后續(xù)分析。
如果在下機前，有部分孔擴增有問題，如雙曲線，不要“剔除”，可以直接將其記錄下來或者清空這個孔的CT（不是改為0），因為一旦“omit”之后，我們后續(xù)篩選時候，導致數(shù)據(jù)不對稱，會比較麻煩，容易出錯。
4. 計算表達值時候，會有一個生物重復做歸一化，即2的0次方為1，案例中的calibrator。這個自己可以選，我習慣將排版的最開始的那一個做歸一。
如果你想將所有表達基因，都可以展示在一張圖片上，那所有值應該都與這個歸一化值做比較。
可以看到，Well Position是比較整齊的，依次為GHIIJK，當篩選基因時候，也會一一對應，不會出錯。
