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題目：Single-cell analyses reveal key immune cell subsets associated with response to PD-L1 blockade in triple-negative breast cancerr 時間：2021年10月 期刊：Cancer Cell ((IF: 31.7) DOI: https://doi.org/10.1016/j.ccell.2021.09.010
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在三陰性乳腺癌（TNBC）中，將化療與檢查點抑制劑相結合的好處仍然不是很清楚。作者利用單細胞RNA和ATAC測序來檢查22名患有晚期TNBC的患者的免疫細胞動力學，這些患者的治療方法是紫杉醇或與阿特珠單抗 (Atezolizumab)的結合。我們證明，高水平的基底CXCL13+ T細胞與巨噬細胞的炎性特征有關，可以預測對組合療法的有效反應。在反應靈敏的患者中，淋巴組織誘導（LTi）細胞、濾泡B（Bfoc）細胞、CXCL13 +T細胞和常規(guī)1型樹突狀細胞（cDC1）在聯(lián)合治療后協(xié)同增加，但在紫杉醇單一療法后則減少。我們的數(shù)據(jù)突出了CXCL13 +T細胞在有效應對抗PD-L1療法方面的重要性，并表明通過紫杉醇療法減少這些細胞可能會損害伴隨阿特珠單抗 (Atezolizumab)進行TNBC治療的臨床結果。
樣本信息和實驗設計
研究人員收集了來自22例TNBC患者（11例接受阿替利珠單抗聯(lián)合紫杉醇化療，11例接受紫杉醇單藥化療）治療前和治療后的78例配對樣本，通過整合單細胞轉錄組測序、T細胞受體序列測序和染色質可及性測序，構建了TNBC患者腫瘤微環(huán)境和外周血來源免疫細胞的高分辨率轉錄組和表觀組動態(tài)圖譜。該研究在單細胞水平上對來自接受兩種治療方案的TNBC病人的腫瘤組織和外周血的免疫細胞進行刻畫，系統(tǒng)比較了響應患者和非響應患者的腫瘤微環(huán)境及外周血免疫特征，闡明了免疫細胞在不同治療方案下的動態(tài)變化，揭示了anti-PD-L1免疫治療聯(lián)合紫杉醇化療在TNBC中的作用機制。
單細胞測序技術
scRNA-seq(10x Genomics) , scTCR-seq和scATAC-seq
部分分析結果
使用不同療制治療的晚期TNBC患者的免疫細胞動力學
經(jīng)過質量過濾，獲得了489，490個高質量免疫細胞的單細胞轉錄組數(shù)據(jù)，其中包括骨髓細胞、先天淋巴細胞（ILCs）、T細胞和B細胞（圖1B）。根據(jù)Pi分析，發(fā)現(xiàn)B細胞是最突出的免疫細胞類型，可以預測對兩種治療方案（圖1C）的有利反應。為了在人類TNBC中生成一個全面的免疫細胞圖集，進一步將來自血液或腫瘤的每一個主要免疫室單獨隔離（STAR方法）。揭示了具有不同分子特征的異質免疫細胞亞型，表明它們具有獨特的細胞特征（圖1B、1D）。
腫瘤滲透T細胞子集的時空動力學
CD8-CXCL13 和 CD4-CXCL13 在 TNBC 腫瘤中擴展，對組合療法有反應。為了破譯治療后的免疫細胞動力學，我們首先研究了不同T細胞子集上紫杉醇的調節(jié)。與非響應者相比，響應者顯示CD8-CXCL13、CD4-CXCL13和Tregs水平下降，同時在紫杉醇治療后CD8 Tem、Teff和CD4細胞水平升高（圖2B、2C和S2D）。有趣的是，CD8-CXCL13 和 CD4-CXCL13 在紫杉醇加阿特珠單抗治療后，在反應靈敏的患者中都有所擴大，導致他們在聯(lián)合治療組中所占的分數(shù)高于治療后單獨的 paclitaxel治療（圖 2B、2C 和S2E）。同樣，我們的 Ti 分析也顯示了組合治療后 CD8-CXCL13 和 CD4-CXCL13 的擴展，相比之下，在反應靈敏的患者中，在 paclitaxel 治療后，它們的減少（圖 2D 和S2F）。這種觀察暗示了CXCL13 T細胞與PD-L1封鎖的相關性。我們進一步利用TCR序列來追蹤對聯(lián)合療法有反應的腫瘤中CXCL13 T細胞的血統(tǒng)起源，并發(fā)現(xiàn)其擴張既包含預先存在的克隆，也包含新滲透的克?。▓D2E和2F）
TNBC腫瘤中B細胞子集的特點和動態(tài)
我們觀察到CD19 B細胞與CD8-CXCL13和CD4-CXCL13 T細胞在TNBC腫瘤中與紫杉醇加阿特朱單抗（圖3A）的共定位。通過比較反應性腫瘤和非反應性腫瘤之間B細胞的轉錄差異，我們發(fā)現(xiàn)，在反應性腫瘤中富含的B細胞，在抗原處理和表達途徑、干擾素（IFN）-γ反應和T細胞活化等途徑中具有高度表達的基因。相比之下，富含非反應性腫瘤的B細胞在B細胞活化、免疫球蛋白生成和幽默免疫反應的通路中表現(xiàn)出高度表達的基因（圖3B和S3D）。
Bfoc 和 Lti 細胞在 TNBC 腫瘤中協(xié)同擴張， 對組合療法有反應。值得注意的是，Bn、Bmem 和 Bfoc 細胞主要富集于對紫杉醇和阿特朱單抗有反應的腫瘤，而不是對紫杉醇有反應的腫瘤（圖 3C 和S3G）。反應者比兩個治療組的非反應者（圖3C和S3G）的基線Bfoc水平要高得多，我們的Pi分析也顯示了Bfoc與有利的臨床反應（圖3D）的關聯(lián)性。重要的是，我們描述了不同的B細胞子集的預后意義，并揭示Bfoc是最重要的B細胞亞型，與BRCA患者的有利臨床結果相關（圖3E：star方法） 。因此，Bfoc似乎是患者生存和ICB免疫治療中最重要的B細胞子集。
接下來，我們檢查了Bfoc與其他免疫細胞的連接。通過描述相關免疫細胞亞型，我們發(fā)現(xiàn)CD4-CXCL13和CD8-CXCL13在細胞比例上與Bfoc呈高相關性，特別是在治療后組（圖3F和S3J）。值得注意的是，ILC3-IL7R可以預測對這兩種治療方案（圖3J）的有利反應，表明其在有效抗腫瘤免疫方面的潛在作用。
cDC1 在 TNBC 腫瘤中擴展，對組合療法有反應
mDC與TNBC腫瘤中的cDC1緊密相連，由于其轉錄相似性和細胞比例的相關動態(tài)變化（圖4C和4D）。對于使用紫杉醇加阿特珠單抗治療的患者，我們還觀察到，與 cDC1 和 pDC 的增加相比，治療后響應者中的 mDC 減少，這可能是由于 paclitaxel 方案選擇性地減少了 mDC（圖 4B）。值得注意的是，mDC 和 cDC1 都展示了與 CD4-CXCL13（圖 4D 和S4H）協(xié)調的時間動力學，我們通過 TCGA BRCA 的批量 RNA-seq 數(shù)據(jù)（圖 4F）證實了它們的相關性。此外，我們還發(fā)現(xiàn)了多個配體受體對，包括 CD40LG-CD40，這些配體受體對可能會在 mDC、cDC1 和 CD4-CXCL13（圖 4G）之間進行調停。有趣的是，CD8-CXCL13還表現(xiàn)出與mDC、cDC1和CD4-CXCL13的高度相關性，基于它們在細胞比例上的時間動態(tài)（圖4D和S4H）。這些觀察暗示CD4-CXCL13和CD8-CXCL13可能都由cDC1或mDC激活。
巨噬細胞子集與TNBC腫瘤中CXCL13 +T細胞的連接
以單細胞/巨噬細胞隔間為重點，我們發(fā)現(xiàn)，與組合治療組的響應者相比，無反應器表現(xiàn)出較高的巨噬細胞基線水平，在非響應器中富含的巨噬細胞高度表達SPP1、TREM2、FN1和C3，而在響應者中富含的巨噬細胞則高度表達CXCL9、MMP9和PLA2G2D （5A）。
我們還檢查了免疫細胞比例，發(fā)現(xiàn)M+-CCL2和M+-MMP9也與CXCL13 T細胞（圖5E）高度相關。值得注意的是，這兩個宏噬菌體子集的基線水平較高，表明對組合療法（圖 5F）有良好的反應。
組合治療后反應性腫瘤中T細胞子集的轉錄和表觀遺傳動力學
轉錄本分析表明，IFNG、GZMK、GZMA和CD44的效應基因和記憶相關基因： TBX21、BHLHE40和 BCL6 的轉錄因子（TFs）： CD28和ICAS的共刺激分子，以及HLA基因和集成物被調高，而疲憊相關的基因，包括HAVCR2，LAYN，TIGIT和LAG3，在治療后在CD8-CXCL13中被降低（圖6A).CD8-CXCL13的表型變化也反映在其疲憊分數(shù)的減少和效應者記憶分數(shù)的增加（圖6B）。CD8-CXCL13細胞的表觀遺傳特征，顯示T細胞衰竭標記物（包括PDCD1、LAG3和CTLA4）的峰值特異性豐富，與CD8 Tex細胞的表觀遺傳特征一致（圖6c）。
我們通過比較組合治療前后的配對 scATAC-seq 數(shù)據(jù)，檢查了 CD8 Tem、CD8-CXCL13 和 CD4-CXCL13 的色度素可及性的全局動態(tài)。每個T細胞子集中微分OCR和相關基因的特征通報了CD8-CXCL13細胞的增強效應和記憶特性，表明CD44、CXCR4、KLRG1、XCL2、CST7、ICOS和CD28的可及性增強，而治療后與衰竭相關的基因（如CREM和 MYO7A）的可及性降低（圖6D）。
TNBC腫瘤免疫細胞特征和動態(tài)摘要
我們調查了晚期TNBC患者免疫細胞的時間動態(tài)，或與阿特朱單抗的結合，并發(fā)現(xiàn)了與患者反應相關的免疫特征（圖7A-7C）。
A） 經(jīng)過不同治療的關鍵免疫細胞子集的特征和動態(tài)。紅色（或綠色）箭頭表示較高的基線水平，預測有利（或不利）反應，或治療后反應靈敏的患者免疫細胞子集的增加（或減少）。
（B） 反應迅速和無反應的腫瘤的免疫特征及其在不同治療方案下的動態(tài)。具有實質性基線CXCL13+ T細胞、B細胞和促炎巨噬細胞的TNBC腫瘤，與具有大量免疫抑制巨噬細胞的TNBC腫瘤的耐藥性相比，對組合療法具有敏感性。紫杉醇療法減少，而阿特珠單抗增加反應性腫瘤的關鍵抗腫瘤免疫細胞。
（C） CXCL13 +T細胞與其相關免疫細胞之間的潛在聯(lián)系，根據(jù)治療引起的時間動力學推斷。
總結
綜上，該研究揭示了TNBC患者對于anti-PD-L1免疫治療敏感和耐藥的分子機制，鑒定了關鍵免疫組分及其在免疫檢查點抑制劑和紫杉醇化療方案下的動態(tài)變化，闡明了紫杉醇化療與阿替利珠單抗聯(lián)合應用不能有效增加TNBC患者治療效果的原因。該課題的研究結果對于當前免疫治療聯(lián)合化療方案有重要指導意義，提示需要進一步系統(tǒng)評估不同化療藥與免疫治療藥聯(lián)合使用的分子機制，才能有效提高聯(lián)合用藥方案對TNBC患者的治療效果。
