Iso-seq基礎(chǔ)概念，轉(zhuǎn)載自https://blog.csdn.net/weixin_34384681/article/details/85937505
Iso-seq , 全稱叫做 Isoform-sequencing, 是 Pacbio 公司對自己開發(fā)的轉(zhuǎn)錄本測序技術(shù)的規(guī)范化命名；是利用三代測序長讀長的特點，不打斷轉(zhuǎn)錄本，直接測序，從而得到全長轉(zhuǎn)錄本的一種測序技術(shù)。

1）ROI

了解過三代測序數(shù)據(jù)分析的人，對于CCS 環(huán)形一致性序列的概念肯定不會陌生，在iso-seq中，提出了比CCS 更加靈活的一個概念：ROI

ROI , 全稱 reads of insert，可以理解為插入片段，首先看下三代測序文庫構(gòu)建階段的reads示意圖：

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對于上述的文庫片段，測序產(chǎn)生的reads 示意圖如下：

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由于是一個環(huán)狀分子， 隨著測序反應(yīng)的進(jìn)行，會循環(huán)測序；如果把插入片段的正負(fù)鏈都測了一次，就做1個full pass;

對于CCS 而言，要求至少有2個full pass , 才能去生成CCS reads; 三代測序的特點就是讀長很長，可以達(dá)到十幾kb, 對于短的插入片段而言，CCS這樣定義當(dāng)然沒有問題，但是對于全長轉(zhuǎn)錄本

而言，轉(zhuǎn)錄本長度很長，比如轉(zhuǎn)錄本長度1kb, 讀長3kb, 此時在一個零模波導(dǎo)孔（ZMW）中測序的reads 就不可能達(dá)到2個full pass , 也就產(chǎn)生不了CCS reads, 為了解決這個問題，提高reads的利用率，提出了ROI 的概念，ROI 指的就是插入片段，上圖測序reads 產(chǎn)生的ROI 如下：

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ROI 不要求滿足2個full pass， 相對CCS 而言，更加適合全長轉(zhuǎn)錄本的分析；

2）artifacts

可以理解為，共有兩種來源：

Artificial Concatemer

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這種序列是由于文庫制備階段，adapter 序列錯誤的將兩條轉(zhuǎn)錄本的序列鏈接構(gòu)成了一個環(huán)狀分子，這個和adapter 濃度有關(guān)，通常這種reads 產(chǎn)生的比例很少，小于0.5%， 在后續(xù)的分析中，這部分reads 需要去除

PCR Chimera

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在PCR 反應(yīng)中，由于不完全延伸的產(chǎn)物作為了下次擴增反應(yīng)的引物，導(dǎo)致出現(xiàn)嵌合體序列，直觀上看，就是PCR產(chǎn)物來源于兩條或者多條reads；

PCR 產(chǎn)生的嵌合體序列，在PCR 反應(yīng)體系中，這種序列是不可避免的，大約有3%的比例，在后續(xù)的分析過程中，可以借助軟件去除這部分reads；

3. FL Reads

FL , Full-length reads, 全長轉(zhuǎn)錄本

從raw data 到 ROI , 在從ROI 去除 artifacts reads 之后，我們就得到了用于后續(xù)分析的clean reads;

clean reads 就已經(jīng)是轉(zhuǎn)錄本的序列了，我們首先看一下clean reads 當(dāng)中，哪些是全長轉(zhuǎn)錄本；哪些不是全長轉(zhuǎn)錄本，這個操作就是分類，classify

全長轉(zhuǎn)錄本的示意圖如下：

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對于全長轉(zhuǎn)錄本而言，其ROI reads 中包含5‘ primer 和 3‘ primer; 而且會出現(xiàn)polyA 為結(jié)構(gòu)；（polyA 針對mRNA和部分lncRNA）

對于不同大小的文庫，其全長轉(zhuǎn)錄本的比例也不同：

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可以看到，文庫片段越長，全長轉(zhuǎn)錄本的比例越低；

4） consensus transcript isoforms

一致性轉(zhuǎn)錄本序列，一個ZMW 產(chǎn)生一個轉(zhuǎn)錄本的reads, 肯定會有冗余的reads 出現(xiàn)，這是通過聚類（cluster）的方式，就全長轉(zhuǎn)錄本序列進(jìn)行聚類，可以得到一致性的轉(zhuǎn)錄本序列；

數(shù)據(jù)分析流程：https://github.com/PacificBiosciences/IsoSeq/blob/master/isoseq-clustering.md

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步驟

software install

$ conda install -c isoseq3 bioconda pbccs lima pbcoretools

Circular Consensus Sequence calling

$ ccs m54045_190809_102313.subreads.bam m54045.ccs.bam -j 20 --min-rq 0.9

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Primer removal and demultiplexing

$ lima m54045.ccs.bam IsoSeqPrimers.fasta m54045.fl.bam -j 20 --isoseq --peek-guess

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Refine

$ isoseq3 refine m54045.fl.primer_5p--primer_3p.bam IsoSeqPrimers.fasta m54045.flnc.bam -j 20 --require-polya

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Clustering Parallel Polishing

$ isoseq3 cluster m54045.flnc.bam clustered.bam --verbose --use-qvs

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