Title：The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease 鏈接：sci-hub

P0: Introduction

P1: Cellular functions of DNA methylation

胞嘧啶甲基化在哺乳動(dòng)物基因組中是普遍存在的，但可能在不同的基因組區(qū)域執(zhí)行不同的功能。此外，即使DNA甲基化與轉(zhuǎn)錄沉默相關(guān)，其內(nèi)在機(jī)制在基因啟動(dòng)子、基因體或重復(fù)序列上也不一定相同。在本節(jié)中，我們將討論DNA甲基化的基因組效應(yīng)和功能機(jī)制的最新證據(jù)。

----p1-1 The writers and erasers of methylation

1）DNA甲基化有三個(gè)階段:建立(從頭DNA甲基化)、維持和去甲基化。
2）在哺乳動(dòng)物中，有兩種主要的DNA重新甲基化酶DNMT3A和DNMT3B
3）DNA甲基化通常不存在于活躍轉(zhuǎn)錄基因的富CpG啟動(dòng)子中。通常富集于三甲基化組蛋白H3Lys4 (H3K4me3)。(圖1a)
4）這強(qiáng)烈表明轉(zhuǎn)錄和基因體DNA甲基化之間存在機(jī)制聯(lián)系(圖1b)。
5）然而從頭DNA甲基化可以發(fā)生在任何序列環(huán)境中，只有對(duì)稱的CpG甲基化在DNA復(fù)制中保持。

image.png

----p1-2 DNA methylation represses transcription

1）DNA甲基化在轉(zhuǎn)錄中的抑制作用長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為與DNA甲基化和基因沉默有關(guān)，基因沉默隨著啟動(dòng)子處CpG二核苷酸密度的增加而增加。然而，這如何導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄抑制仍然沒(méi)有完全解決，因?yàn)榧谆鶚?biāo)記本身似乎并不意味著沉默。
2）接近染色質(zhì)的區(qū)域通常是低甲基化或未甲基化的，這表明轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合和DNA甲基化是相互排斥的。某些轉(zhuǎn)錄因子對(duì)CpG甲基化敏感:最近對(duì)542個(gè)人類轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，與未甲基化相比，有117個(gè)(22%)的轉(zhuǎn)錄因子甲基化后與基序的結(jié)合減少。通過(guò)阻止這些轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，DNA甲基化可以因此阻礙包含序列識(shí)別基序的CGI啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活。
3）DNA甲基化也可以通過(guò)DNMT蛋白招募染色質(zhì)重構(gòu)因子和修飾因子來(lái)促進(jìn)異染色質(zhì)的形成。
4）哺乳動(dòng)物有五種MBD蛋白:MBD1-MBD4和甲基-cpg結(jié)合蛋白2 (MeCP2)。四種MBD蛋白表現(xiàn)出CpG結(jié)合增加和CpG甲基化增加之間的線性關(guān)系，但MBD3不偏愛(ài)甲基化胞嘧啶。所有的MBDs與核小體重構(gòu)和組蛋白去乙酰化酶復(fù)合物相互作用，導(dǎo)致基因沉默。

----p1-3 CpG-island promoters

1）哺乳動(dòng)物的基因組通常CpG較少，CpG島(CGIs)是相對(duì)較小的基因組區(qū)域，平均約為1kb。超過(guò)三分之二的哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子是CGI，幾乎所有的管家基因都有CGI啟動(dòng)子，一些發(fā)育調(diào)節(jié)的基因也有。
2）cgi很少被甲基化;它們?cè)诜至训男坌陨臣?xì)胞中尤其未被甲基化，這解釋了為什么它們?cè)谶M(jìn)化過(guò)程中不受脫氨作用的CpG侵蝕，以及它們顯著高的CpG含量。
3）存在三大類基因：其中在體細(xì)胞組織中穩(wěn)定的、終身DNA甲基化沉默（0不活躍X染色體上的基因、印記基因）和種系特異性基因。在這里，我們討論DNA甲基化可以針對(duì)這些特定類別的CGI啟動(dòng)子。

--------p1-3-1 X-chromosome inactivation（XCI）

每個(gè)細(xì)胞的X染色體被非編碼RNA（XIST）的順式活性隨機(jī)沉默。在XCI的這一過(guò)程中，X-連鎖cgi的DNA甲基化出現(xiàn)的時(shí)間相對(duì)較晚，并在基因已經(jīng)沉默后起到最后鎖定的作用。

--------p1-3-2 Genomic imprinting

在基因組印跡中，DNA甲基化在兩個(gè)親本種系中存在差異;這些表觀遺傳印跡模式能夠抵御在早期胚胎發(fā)生期間發(fā)生的DNA甲基化的基因組重編程。在小鼠和人類中，大約20個(gè)被稱為“印跡控制區(qū)”(ICRs)的基因組區(qū)域能夠經(jīng)受這種重編程，并迫使鄰近基因的單等位基因表達(dá)95 - 101。大多數(shù)的icr在卵母細(xì)胞中被甲基化，這些都與極度富含CpG的CGIs101相一致，而三個(gè)父系icr定位于CpG差的基因間序列。在卵母細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中，DNMT3A在DNMT3L的輔助下甲基化了卵母細(xì)胞表達(dá)的基因體，包括其轉(zhuǎn)錄依賴的基因內(nèi)cgi，而其余的基因組仍為低甲基化35,102 - 106(圖2b)。哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄通常來(lái)自典型CGI啟動(dòng)子(受精后使用)上游的替代啟動(dòng)子，并且經(jīng)常與逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的序列相一致106 - 109。母系(以及父系)icr與配子中其他被甲基化的序列的區(qū)別在于它們?cè)谔囟ㄟz傳基序(TGCCGC)中的富集，當(dāng)甲基化時(shí)，會(huì)被Krüppel- associated box (KRAB)所識(shí)別鋅指蛋白57 (ZFP57) 110-112(圖2b)。ZFP57招募KRAB相關(guān)蛋白1 (KAP1;也被稱為TIF1β)和其他沉默因子，包括dnmts111,1131,114。ZFP57-KAP1在卵母細(xì)胞中的選擇性DNA結(jié)合允許ICRs在受精后胚胎中保持等位基因特異性的甲基化，這經(jīng)歷了全面的DNA甲基化消除和重建。值得注意的是，Zfp57的突變?cè)谛∈笾胁⒉皇峭耆珴B透的:最近的一項(xiàng)研究表明，一個(gè)類似的蛋白質(zhì)，ZFP445，在幾乎所有的icr中與Zfp57合作，維持小鼠的甲基化印跡，并且可能比Zfp57在人類中的作用更重要115。總之，母體印跡cgi進(jìn)行DNA甲基化的能力依賴于卵母細(xì)胞不尋常的轉(zhuǎn)錄景觀和特定的遺傳序列的結(jié)合

--------p1-3-3 Germline- specific genes

胚系特異性基因的CGI啟動(dòng)子被DNMT3B介導(dǎo)的DNA甲基化沉默，在胚胎植入期間體細(xì)胞分化開(kāi)始27,116。種系基因?qū)NA甲基化缺失非常敏感，并在Dnmt三敲除小鼠ESCs117、dnmt1缺失的人類成纖維細(xì)胞118、Dnmt3B突變的小鼠胚胎27,119和與Dnmt3B突變相關(guān)的人類疾病中被抑制120。是什么讓只占CGI總數(shù)5%的種系基因的CGI啟動(dòng)子依賴于DNA甲基化，而大多數(shù)常染色體富含CpG的啟動(dòng)子仍未甲基化?其中的關(guān)鍵可能是非典型的Polycomb抑制復(fù)合物1 (PRC1)，即已知的PRC1.6，它是小鼠escs121122中種系基因抑制的調(diào)節(jié)因子。該復(fù)合物包含DNA結(jié)合蛋白123，提供序列特異性靶向，如MAX121,124, MGA121,122和E2F6(參考文獻(xiàn)125)。此外，PRC1.6與L3MBTL2 (reFs126,127)相關(guān)，L3MBTL2與H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶G9A(也稱為EHMT2)126相互作用。小鼠G9a突變的胚胎不能獲得大量種系特異性基因的特異性DNA甲基化119(圖2c)。PRC1.6在抑制種系特異性基因方面的許多作用尚不清楚，例如DNMT3B是如何靶向種系基因的cgi，而DNMT3A卻不是。然而，與大多數(shù)CGI啟動(dòng)子在植入時(shí)抵抗DNA重新甲基化相反，種系CGI已經(jīng)進(jìn)化出特定序列的方法來(lái)招募DNA甲基化機(jī)制，以確保終身的體細(xì)胞沉默。

----p1-4 Harnessing the repetitive genome

對(duì)轉(zhuǎn)座因子的基因組防御被認(rèn)為是DNA甲基化進(jìn)化的主要驅(qū)動(dòng)因素。事實(shí)上，哺乳動(dòng)物基因組中DNA甲基化的主要目標(biāo)不是基因，而是轉(zhuǎn)座子，特別是逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。在小鼠和人類基因組中有數(shù)百萬(wàn)個(gè)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的拷貝，它們大約占據(jù)了基因組空間的一半130。最活躍的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的表達(dá)是由富含CpG的啟動(dòng)子控制的，而DNA甲基化對(duì)它們的表達(dá)至關(guān)重要轉(zhuǎn)錄沉默。這在小鼠Dnmt1敲除胚胎中得到了例證，其中腦內(nèi)A粒子(IAP)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(構(gòu)成了一類進(jìn)化上仍能在嚙齒動(dòng)物基因組中積極調(diào)動(dòng)的年輕逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子)被大量解除抑制131(圖3a)。兩個(gè)獨(dú)立的小鼠遺傳篩選最近發(fā)現(xiàn)了DNMT3C，這是一個(gè)先前未知的denovo DNMT，在控制逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子129,132中具有特定的作用(表1)。DNMT3C最初被注釋為假基因，起源于muro總科譜系中Dnmt3B基因的串聯(lián)重復(fù)鼠科嚙齒動(dòng)物的超科，包括小鼠和大鼠在進(jìn)化過(guò)程中，DNMT3C失去了PWWP結(jié)構(gòu)域，但保持了其ADD和從頭甲基化活性。DNMT3A和DNMT3B在兩性的不同發(fā)育環(huán)境中廣泛表達(dá)，而DNMT3C的表達(dá)僅限于男性胎兒生殖細(xì)胞。盡管純合子Dnmt3C-突變小鼠是可以存活的，但雄性的睪丸較小且不能生育(圖3a)。全基因組甲基化分析顯示，DNMT3C選擇性地甲基化并抑制了進(jìn)化年輕轉(zhuǎn)座因子的啟動(dòng)子，這只占小鼠基因組的1% 129。Dnmt3C突變體的分子表型與種系甲基化輔助因子DNMT3L35突變體和piwi相互作用RNA通路突變體的分子表型相同;匹威- rna相互作用基因組缺乏DNMT3C基因。也許人類PWWP- less DNMT3B亞型與嚙齒動(dòng)物DNMT3C具有相似的功能;另外，小rna導(dǎo)向的DNA甲基化可能在人類中并不以同樣的方式存在，相反，我們進(jìn)化出了一種不同的機(jī)制來(lái)控制轉(zhuǎn)座因子。除了抑制轉(zhuǎn)座因子的短期效應(yīng)，DNA甲基化也通過(guò)誘變脫氨促進(jìn)其不可逆的基因失活。最后，DNA甲基化可能通過(guò)限制具有高度序列相似性的轉(zhuǎn)座子的非等位拷貝之間的重組來(lái)支持基因組的穩(wěn)定性。在各種人類癌癥中，染色體重排水平升高和全基因組DNA低甲基化(主要涉及轉(zhuǎn)座因子)之間的正相關(guān)支持了這種可能性140。此外，在減數(shù)分裂期間，DNA甲基化可能限制轉(zhuǎn)座因子參與同源依賴的搜索和重組141。需要指出的是，DNA甲基化不僅可以通過(guò)靶向分散的轉(zhuǎn)座子重復(fù)，還可以通過(guò)靶向端粒、著絲粒和著絲粒間的串聯(lián)衛(wèi)星重復(fù)來(lái)發(fā)揮基因組穩(wěn)定性保護(hù)功能(見(jiàn)別處綜述142)。與體內(nèi)情況形成鮮明對(duì)比的是，除IAPs外，轉(zhuǎn)座因子在構(gòu)成性DNA甲基化缺陷的小鼠ESC模型中沒(méi)有重新激活，它們的上調(diào)僅在Dnmt1敲除或Dnmt三敲除細(xì)胞中溫和。然而，通過(guò)有條件地觸發(fā)DNA甲基化的消融，最近的獨(dú)立研究表明，包括IAPs在內(nèi)的幾類轉(zhuǎn)座因子確實(shí)在DNA甲基化停止后被重新激活145 - 147。在這一初始反應(yīng)之后，組蛋白甲基化恢復(fù)了低甲基化基因組的長(zhǎng)期轉(zhuǎn)錄沉默。根據(jù)轉(zhuǎn)座因子的種類，沉默涉及H3K9me3、H3K27me3或兩者的結(jié)合(圖3c)。矛盾的是，當(dāng)Dnmt1的DNA靶向輔助因子UHRF1被移除時(shí)，Dnmt1有條件刪除后的IAP重新激活的初始爆發(fā)并沒(méi)有被觀察到(參考146)。這種差異的基礎(chǔ)已經(jīng)從遺傳學(xué)上剖析過(guò):在Dnmt1突變體中，抑制復(fù)制后DNA甲基化的維持最初會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的半甲基化DNA，短暫地延長(zhǎng)UHRF1在DNA上的駐留時(shí)間，從而抑制組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(組蛋白賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶SETDB1)的募集。H3K9三甲基化和IAPs沉默的催化作用(圖3d)。經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)和半甲基化DNA的逐漸稀釋，基于uhrf1的組蛋白甲基化抑制被緩解，setdb1介導(dǎo)的沉默被激活。有趣的是，半甲基化DNA的積累在體內(nèi)特定的發(fā)育環(huán)境中自然發(fā)生146。這是否導(dǎo)致IAP重新激活取決于UHRF1的核可用性，例如在小鼠胎盤中。這種情況不會(huì)發(fā)生在早期胚胎或遷移的原始生殖細(xì)胞(PGCs)中，在這些細(xì)胞中，UHRF1隔離在細(xì)胞質(zhì)中，不能通過(guò)H3K9甲基化來(lái)抵消setdb1介導(dǎo)的抑制146

----p1-5 The puzzling case of gene bodies

基因體中DNA甲基化的富集提出了一個(gè)悖論:一方面，基因體甲基化在真核生物中高度保守，比轉(zhuǎn)座因子保守的多，這表明它具有重要的功能1,2。另一方面，DNA甲基化具有誘變作用，那么為什么它在編碼序列中如此突出呢?重要的是，基因體DNA甲基化與轉(zhuǎn)錄正相關(guān)29,148,149，因此，其作用與基因沉默無(wú)關(guān)。對(duì)于基因體中DNA甲基化的功能，人們提出了兩種假說(shuō):一是它有助于轉(zhuǎn)錄延伸和/或共轉(zhuǎn)錄剪接，二是它抑制基因內(nèi)隱啟動(dòng)子。相對(duì)于內(nèi)含子(29,150)，DNA甲基化在外顯子上富集，并可能影響Pol II的加工能力，并通過(guò)此影響剪接。核小體在外顯子上也富集，而從頭DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性需要組蛋白結(jié)合，這可以解釋在外顯子上DNA甲基化富集。一些研究表明，DNA甲基化影響剪接和基因表達(dá)，而不是反之。在人類CD45基因上，CCCTC結(jié)合因子(CTCF)減緩了第5外顯子的Pol II延伸率，從而促進(jìn)了其包含;DNA甲基化阻止CTCF結(jié)合，從而導(dǎo)致外顯子排除154。相比之下，在其他位點(diǎn)，DNA甲基化可以通過(guò)招募MeCP2促進(jìn)外顯子包含(reF.155)，這與觀察結(jié)果一致，替代外顯子的平均DNA甲基化水平低于組成外顯子151。此外，異染色質(zhì)蛋白1可以通過(guò)將剪接因子招募到甲基化DNA156包裹的H3K9me3修飾的核小體上來(lái)調(diào)節(jié)外顯子包涵體。然而，這些機(jī)制只能解釋一部分可選剪接事件。第二個(gè)假設(shè)——DNA甲基化會(huì)抑制基因內(nèi)啟動(dòng)子——有很多吸引人的原因。首先，這與DNA甲基化作為轉(zhuǎn)錄抑制因子是一致的。此外，如上所述(圖1b)， DNA從頭甲基化機(jī)制通過(guò)與H3K36me3結(jié)合而被招募到DNA上，這可以防止在面包師酵母中使用隱蔽的啟動(dòng)子157。的確，基因內(nèi)cgi的甲基化抑制了啟動(dòng)子的活性，在哺乳動(dòng)物中，差異甲基化可以以組織特異性和細(xì)胞類型特異性的方式調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始158。然而，從小鼠到人類，基因內(nèi)cgi通常是保守的，而且更可能是替代啟動(dòng)子而不是非法的、隱秘的啟動(dòng)子。最近一項(xiàng)對(duì)小鼠ESCs的研究表明，DNMT3B介導(dǎo)的基因體甲基化限制了H3K36me3下游隱啟動(dòng)子的活性(reF.159)。雖然這一發(fā)現(xiàn)很吸引人，但觀察到的效果，雖然在統(tǒng)計(jì)上很顯著，只發(fā)生在細(xì)胞群中很小比例的細(xì)胞。此外，Dnmt三重敲除的ESCs并不像Dnmt3B單突變細(xì)胞那樣抑制基因內(nèi)隱啟動(dòng)子。需要更多的功能分析來(lái)確認(rèn)DNA甲基化在其中的作用抑制隱藏的啟動(dòng)子，特別是在小鼠ESCs以外的細(xì)胞類型中，其中DNA甲基化不需要細(xì)胞活力和其他安全措施可能在基因體中。綜上所述，上述兩種假設(shè)都是合乎邏輯和合理的，并不必然相互排斥。在這兩種情況下，DNA甲基化似乎至多是一個(gè)微調(diào)器，因?yàn)榛蝮w甲基化的丟失不會(huì)導(dǎo)致劇烈的分子表型。未來(lái)的工作可能會(huì)揭示隱藏的機(jī)制和/或功能，這將有助于解釋基因體中高度保守的DNA甲基化流行。

P2: Methylation patterning in development

哺乳動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中DNA甲基化重編程的發(fā)現(xiàn)是在30多年前。然而,直到全-亞硫酸氫基因組測(cè)序的出現(xiàn),DNA甲基化模式可以評(píng)估與單核苷酸決議,,最近,使用少量的細(xì)胞(補(bǔ)充箱2)。隨后,技術(shù)已經(jīng)開(kāi)發(fā)評(píng)估5 mc的氧化形式相同的精度。在本節(jié)中，我們將描述這些技術(shù)在DNA甲基化發(fā)展過(guò)程中所提供的最新微妙發(fā)現(xiàn)和修正的見(jiàn)解。

----p2-1 Early embryos and the germlines

哺乳動(dòng)物表觀遺傳重編程的傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，在早期胚胎和種系發(fā)育期間，DNA甲基化的廣泛消失。這可能是在重要的發(fā)育階段獲得表觀遺傳可塑性所必需的，但也限制了獲得性外突變的遺傳。然而，在早期胚胎發(fā)生和種系發(fā)育中，DNA甲基化重編程的機(jī)制有關(guān)鍵的區(qū)別，盡管在這兩種情況下，目前已經(jīng)清楚，該過(guò)程既不是完全的，也不是完全線性的:有限數(shù)量的序列可以抵抗DNA甲基化損失，并且在這個(gè)過(guò)程中可能發(fā)生重新的DNA甲基化。

--------p2-1-1 Global passive and active demethylation and local de novo methylation

全基因組DNA去甲基化一直是一個(gè)有爭(zhēng)議的研究領(lǐng)域。在生殖系重編程中，PGCs161,162中生殖細(xì)胞身份的獲得伴隨著兩步去甲基化。第一階段包括作為默認(rèn)路徑的大部分基因組被動(dòng)去甲基化163 - 165。接下來(lái)是tet1依賴和tet2依賴的去甲基化，主要影響印跡位點(diǎn)和種系特異性基因(圖4a)，與小鼠PGC核中5hmC的出現(xiàn)相一致164 - 166。在受精后的重編程過(guò)程中，胚胎在向多能性發(fā)展的過(guò)程中，失去了從卵母細(xì)胞和精子遺傳的配子特異性DNA甲基化模式;這也發(fā)生在兩個(gè)階段。在小鼠單細(xì)胞階段的胚胎(受精卵)中，TET3介導(dǎo)的5hmC和5mC缺失的共同出現(xiàn)表明，父基因組最初被TET3主動(dòng)去甲基化(reFs167-169);隨后，由于卵母細(xì)胞提供的維持酶DNMT1在隨后的細(xì)胞分裂中被排除在細(xì)胞核之外，兩個(gè)親代基因組將經(jīng)歷一輪被動(dòng)的、依賴于DNA復(fù)制的DNA甲基化稀釋過(guò)程。該模型受到最近三次全基因組亞硫酸氫鹽測(cè)序分析的挑戰(zhàn)，這三次全基因組測(cè)序分析是對(duì)兩個(gè)小鼠品系雜交胚胎進(jìn)行的(以推斷可用的單核苷酸多態(tài)性的親本特異性)，并結(jié)合全基因組5hmC定位，這表明母體甲基組在受精卵171 - 173中也經(jīng)歷了有限的tet3依賴性氧化。其他研究也表明，大多數(shù)合子DNA甲基化丟失獨(dú)立于復(fù)制174，在父基因組，這可能通過(guò)一種不清楚的機(jī)制以tet3獨(dú)立的方式發(fā)生m174,175。盡管人類的數(shù)據(jù)比較有限，但它們表明，通常情況下發(fā)生了類似的動(dòng)態(tài)變化，只是有一些物種特有的差異。最初的快速去甲基化也主要影響人類胚胎的父親基因組，但它發(fā)生在受精到雙細(xì)胞階段，而它在小鼠的單細(xì)胞階段完成176 - 178。然后，整個(gè)基因組的DNA甲基化逐漸消失，直到囊胚期，盡管與小鼠相比，人類母體基因組的DNA甲基化水平較高179。單細(xì)胞全基因組亞硫酸氫鹽測(cè)序發(fā)現(xiàn)，人類胚胎基因組在進(jìn)行全基因組去甲基化的同時(shí)，DNA從頭甲基化普遍存在:首先是單細(xì)胞階段的父系基因組，然后是八細(xì)胞階段的全基因組，與胚胎基因組激活相一致179，主要針對(duì)轉(zhuǎn)座因子。在小鼠發(fā)育過(guò)程中，一些從頭DNA甲基化也可能與胚胎或種系基因組的整體去甲基化同時(shí)發(fā)生。事實(shí)上，在父合子基因組中獲得5hmC之前5mC就已經(jīng)丟失174;因此，必須在這個(gè)時(shí)間窗內(nèi)發(fā)生DNA重新甲基化，為TET酶氧化提供5mC。類似地，在活躍的種系去甲基化過(guò)程中，TET1可能有助于維持低甲基化狀態(tài)，以應(yīng)對(duì)虛假的DNA重新甲基化事件180?？傊?，在胚胎和種系的DNA甲基化清除過(guò)程中，TET的主要作用可能是防止異位DNA甲基化，而不是驅(qū)動(dòng)主動(dòng)去甲基化。

--------p1-3-1 Methylation reprogramming and the biological implications of resisting it

雖然胚胎和種系去甲基化是全局的，但在這兩個(gè)過(guò)程的末尾仍存在大量的DNA甲基化。這一觀察結(jié)果提出了存在代際表觀遺傳甚至跨代際表觀遺傳的有趣可能性。在植入前胚胎的內(nèi)細(xì)胞群中，小鼠171和人類179中大約20%的cpg保留配子遺傳的甲基化(圖4a)。這些明顯地映射到ICRs，正如預(yù)期的，從基因組印記的代際性質(zhì)，這與序列特異性的DNA去甲基化抗性通過(guò)krabzfp招募KAP1 (refs111,1131,114)相連。然而，總的來(lái)說(shuō)，icr只占基因組的很小一部分。除了這些經(jīng)典的icr，有數(shù)百種“瞬時(shí)”甲基化印跡:這些主要遺傳自卵母細(xì)胞，維持母體特異性DNA甲基化直到囊胚期，可能通過(guò)krabzfp依賴的保護(hù)，類似于經(jīng)典的ICRs101,115，并在植入后通過(guò)DNA去甲基化或再甲基化失去它101,176,179。這一現(xiàn)象可能在人類中尤其普遍，在植入前，母親基因組的DNA甲基化保存明顯高于父親基因組，植入后也是如此，只存在于胎盤組織130179。Zdbf2基因位點(diǎn)的瞬時(shí)印記在小鼠和人類中都是保守的，研究表明，父系等位基因的瞬時(shí)低甲基化可以通過(guò)一系列下游表觀遺傳變化導(dǎo)致長(zhǎng)期的印記，影響出生后的大小182,183(圖4b)。未來(lái)的工作將需要評(píng)估其他短暫印記是否有發(fā)展作用。囊胚中剩余配子甲基化的大部分與單拷貝序列無(wú)關(guān)，而是與轉(zhuǎn)座因子有關(guān)。在小鼠中，IAP類的Y young逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子對(duì)植入前去甲基化尤其耐藥。在人類囊胚中，在進(jìn)化初期和潛在活躍的轉(zhuǎn)座因子上也觀察到最高的DNA甲基化保留，特別是人類特有的SINE- VNRT-Alu因子178。有跡象表明，DNA甲基化通過(guò)krabzfp介導(dǎo)的序列特異性招募KAP1 (reF.186)以類似于icr中KAP1的選擇性DNA結(jié)合的方式被保留。krabzfps需要時(shí)間來(lái)匹配最近出現(xiàn)的轉(zhuǎn)座因子187，因此最近的IAP因子通常在小鼠品系之間具有多態(tài)性，在植入前發(fā)育期間對(duì)DNA甲基化重編程不具有抗性188。與植入前發(fā)育相比，種系去甲基化波更為廣泛。在小鼠胚胎發(fā)生的第13.5天，PGCs僅表現(xiàn)出6-8%的甲基化CpGs171(圖4a)。在懷孕9周后，類似的基礎(chǔ)水平仍保留在人類胎兒生殖細(xì)胞中189,190。與胚胎發(fā)育相反，icr在發(fā)育PGCs時(shí)發(fā)生去甲基化，這是在雄性和雌性生殖系分化過(guò)程中獲得性別特異性DNA甲基化模式的先決條件。與植入前發(fā)育中的甲基化重編程類似，種系DNA甲基化的保留主要見(jiàn)于年輕的和潛在有害的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。在小鼠中，這包括內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒1類逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(ERV1)的IAPs和長(zhǎng)末端重復(fù)元件161,191。在人類中，sin - VNRT-Alu (SV A)元素和長(zhǎng)散布核元素(LINE)家族的人類特定元素與基因組的其他部分相比，以及與靈長(zhǎng)類譜系中分布更廣泛、因此更早的較老的LINE類型相比，仍存在部分甲基化。由于難以定位基因組中的重復(fù)元件，尚不清楚相同的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子拷貝是否同時(shí)抵抗胚胎和種系去甲基化，或者它們是否代表不同的元件集。因此，是否年輕的轉(zhuǎn)座因子有助于表觀遺傳尚不清楚。然而，盡管非常罕見(jiàn)，一些單拷貝序列也逃脫了胚系DNA甲基化重編程小鼠和人類;有趣的是，這些序列在兩個(gè)物種之間顯示出非常低的序列水平和同位保守。更有趣的是，在胚胎甲基化重編程過(guò)程中，人類生殖系逃逸基因序列的DNA甲基化通常也不會(huì)被清除。這些稀疏序列是否可以作為表觀遺傳的載體是一個(gè)誘人的可能性。

----p2-2 The de novo DNA methylation programme

在PGCs中進(jìn)行重編程后，性別特異性的DNA甲基化模式在男性和女性種系中建立。配子體發(fā)育結(jié)束時(shí)，精子基因組CpG甲基化率約為80%，基因組分布與體細(xì)胞相似，但DNA甲基化率略高。相比之下，卵母細(xì)胞基因組的甲基化僅為~50%，而且?guī)缀踔话l(fā)生在基因體105,171,192(圖4a)。卵母細(xì)胞的相對(duì)低甲基化與DNMT1的細(xì)胞質(zhì)保留有關(guān)，DNMT1本身次于由STELLA193蛋白將UHRF1隔離到細(xì)胞質(zhì)。在Stella-突變的卵母細(xì)胞中，DNMT1進(jìn)入細(xì)胞核，導(dǎo)致異位DNA甲基化沉積，DNA甲基化增加兩倍，導(dǎo)致女性不育。令人困惑的是，這表明DNMT1能夠在卵母細(xì)胞中重新發(fā)生DNA甲基化，但在胚胎細(xì)胞中卻不是這樣33。在小鼠和人類中，卵母細(xì)胞DNA甲基化的基因體特異性與從頭DNA甲基化與基因轉(zhuǎn)錄的緊密耦合有關(guān)106,177。然而，這兩個(gè)物種之間存在著顯著的差異。首先，基因體甲基化嚴(yán)格要求DNMT3L介導(dǎo)小鼠卵母細(xì)胞中DNMT3A的刺激192，而DNMT3L在人類卵母細(xì)胞中不表達(dá)177。第二，在小鼠和人類卵母細(xì)胞中，成千上萬(wàn)的突觸區(qū)顯示出不同的DNA甲基化模式。這些差異最近被發(fā)現(xiàn)與長(zhǎng)末端重復(fù)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的物種特異性插入有關(guān)，該轉(zhuǎn)座子在卵子發(fā)生期間的轉(zhuǎn)錄水平特別高109。通過(guò)定義卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中的新的轉(zhuǎn)錄單位，這些元素似乎是發(fā)育和哺乳動(dòng)物進(jìn)化過(guò)程中卵母細(xì)胞甲基化的重要貢獻(xiàn)，也是新的母系印跡位點(diǎn)出現(xiàn)的潛在驅(qū)動(dòng)因素(圖2b)。年底胚胎重組-在老鼠胚胎4.5天囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán),會(huì)形成外胚層然后胚胎組織,和trophoectoderm和原始內(nèi)胚層,造成額外的形成,胚胎組織:胚胎外內(nèi)胚層(ExE)和內(nèi)臟內(nèi)胚層。最近的兩項(xiàng)全基因組分析研究證實(shí)，ExE和內(nèi)臟內(nèi)胚層相對(duì)于外胚194,195都是低甲基化的(圖4a)。DNA低甲基化持續(xù)存在于分化的胎盤中，主要來(lái)源于ExE細(xì)胞196,197。低甲基化與DNMT3酶與外胚層相比表達(dá)降低，甚至逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子相對(duì)低甲基化194。相比之下，ExE和內(nèi)臟內(nèi)胚層中有一類特定的CGI啟動(dòng)子被甲基化，但外胚層中沒(méi)有。與這組啟動(dòng)子相關(guān)的基因在發(fā)育過(guò)程中非常重要:它們的甲基化增加要么反映了在胚胎外組織中抑制它們的需要，要么表明胚胎組織有更嚴(yán)格的機(jī)制來(lái)防止異常的DNA甲基化和長(zhǎng)期沉默。植入后外胚層基因組的再甲基化非常迅速:體細(xì)胞組織水平的DNA甲基化已經(jīng)在小鼠胚胎第6.5天達(dá)到(reFs171,198)(圖4a)。這是值得注意的，因?yàn)橥馀邔痈杉?xì)胞仍然是多能性的，所以在外胚層干細(xì)胞中建立的DNA甲基化模式有可能在所有組織中傳播，并維持早期胚胎發(fā)生的表觀遺傳記憶。然而，對(duì)小鼠101,197和人類149,199,200的全基因組調(diào)查顯示，不同成人組織之間的DNA甲基化模式存在廣泛而局部的差異，這表明在組織分化過(guò)程中發(fā)生了DNA重新甲基化和去甲基化的微波處理。在小鼠中，大多數(shù)(75%)的組織特異性差異DNA甲基化區(qū)域位于增強(qiáng)子或其他調(diào)控元件上，這與研究顯示增強(qiáng)子進(jìn)行活躍的DNA甲基化轉(zhuǎn)換有關(guān)，這可能是TET2和組織特異性轉(zhuǎn)錄因子201,202共同作用的結(jié)果(圖4c)。在人類中，少數(shù)DNA甲基化區(qū)域(<50%)與調(diào)控元件相連;一個(gè)大的子集發(fā)現(xiàn)在不明確的區(qū)域，那里的功能相關(guān)性差異的DNA甲基化是不清楚的。小鼠和人類數(shù)據(jù)集之間的一些差異可能是由于人類研究的更大的測(cè)序深度199，這可能允許從數(shù)據(jù)中進(jìn)行更細(xì)致入微的推斷。大腦在體細(xì)胞組織中表現(xiàn)出一種特殊的甲基組。在小鼠和人類中，DNMT3A203-205產(chǎn)生的CpA甲基化在出生后出現(xiàn)峰值。事實(shí)上，神經(jīng)組織中總CpA的甲基化水平與CpG的甲基化水平大致相當(dāng)，但由于CpA是一種更為普遍的二核苷酸，mCpA的甲基化頻率比mCpG低。最近的研究表明，在年輕小鼠神經(jīng)元的基因體中，MBD蛋白MeCP2與mcc序列結(jié)合，并且MeCP2結(jié)合在生命后期維持了這些基因的沉默(206,207)(圖4d)。這一機(jī)制可以幫助我們理解DNA甲基化，特別是非CpG甲基化在調(diào)節(jié)神經(jīng)和行為特征中的作用。未來(lái)的研究有望進(jìn)一步闡明生命早期缺陷DNA甲基化是如何導(dǎo)致神經(jīng)元異常的。表觀基因組編輯可能被證明是探索這些問(wèn)題的有效途徑208(框2)。

p3 Genetic diseases, epigenetic outcomes

在DNMT和TET基因中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了疾病相關(guān)的突變。它們對(duì)DNA甲基化模式的影響是非常不同的，正如它們的組織和病理表現(xiàn)，從先天性的血液系統(tǒng)癌癥的免疫缺陷綜合征、生長(zhǎng)表型或神經(jīng)變性。其他表型重疊的綜合征與已知的基因有關(guān)，但也與那些在DNA甲基化和去甲基化方面具有未知功能的基因有關(guān)。DNA甲基化途徑中基因突變的特性極大地豐富了我們對(duì)基于DNA甲基化的基因調(diào)控的復(fù)雜性和特異性的理解。

----p3-1 DNMT1 and neurological disorders

DNMT1的雜合突變已在一系列常染色體顯性形式的進(jìn)行性認(rèn)知和行為惡化中被確認(rèn)，包括遺傳性感覺(jué)自主神經(jīng)病變1E伴癡呆和聽(tīng)力損失(HSNA1E;OMIM 614116)209和常染色體顯性小腦共濟(jì)失調(diào)、耳聾和嗜睡(ADAC- DN;OMIM 604121)210(表1)。HSNA1E的平均發(fā)病年齡在37歲左右，以聽(tīng)力和感覺(jué)喪失為最初癥狀，隨后是認(rèn)知功能下降、共濟(jì)失調(diào)和腦萎縮211。平均預(yù)期壽命為50歲，癡呆癥是發(fā)病率的主要驅(qū)動(dòng)因素。值得注意的是，所有DNMT1突變都發(fā)生在RFTS區(qū)域，HSNA1E突變聚集在該區(qū)域的氨基端和中間部分，ADAC- DN突變明顯分離到羧基端。如上所述，RFTS的正確折疊對(duì)DNMT1的功能至關(guān)重要52,53。HSNA1E或ADAC- DN患者的外周血全基因組分析表明，與未受影響的同胞相比，DNA甲基化的紊亂程度非常溫和，存在基因間區(qū)域的低甲基化和部分CGIs212,213的高甲基化。這些DNA甲基化特征可能被用作可獲得的細(xì)胞類型的病理生物標(biāo)記，但它們可能不一定與疾病的腦特異性表現(xiàn)有關(guān)。有趣的是，在基于細(xì)胞的過(guò)表達(dá)分析中，DNMT1蛋白突變的RFTS結(jié)構(gòu)域形成細(xì)胞質(zhì)聚集物，而野生型DNMT1通常是有核的211。蛋白質(zhì)聚集誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)激可導(dǎo)致中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的毒性和年齡依賴性的變性。

----p3-2 DNMT3B and immunodeficiency

免疫缺陷、著絲粒不穩(wěn)定和面部異常(ICF)綜合征(OMIM 602900)是第一個(gè)與先天性DNA甲基化缺陷相關(guān)的遺傳疾病214(表1)。ICF患者患有非典型免疫球蛋白缺乏癥，會(huì)導(dǎo)致復(fù)發(fā)性和經(jīng)常危及生命的感染。典型的ICF診斷包括多輻射染色體1、9和16的核型，與粒間粒衛(wèi)星重復(fù)序列II和III的特異性低甲基化相關(guān)。ICF1是DNMT3B基因的隱性突變，占ICF病例的絕大多數(shù)。正如預(yù)期的那樣，考慮到Dnmt3B功能缺失突變小鼠模型的致死率33，大多數(shù)ICF1突變導(dǎo)致單個(gè)氨基酸替換或缺失，并被認(rèn)為導(dǎo)致Dnmt3B活性的降低而不是消除。盡管ICF缺乏(僅報(bào)道了70例)，但它與其他三個(gè)基因的種系突變有關(guān)，其產(chǎn)物被認(rèn)為有助于DNA甲基化:鋅指和含有BTB結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)24 (ZBTB24;定義ICF2)，細(xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白7 (CDCA7;ICF3)和HELLS(編碼LSH;ICF4) 216217。有趣的是，雖然近端粒衛(wèi)星重復(fù)低甲基化是ICF的一個(gè)標(biāo)志，但也有ICF類型特異性缺陷，指向DNMT3B與ZBTB14、CDCA7和LSH218之間差異基因組背景依賴的相互作用。值得注意的是，具有ICF1的個(gè)體表現(xiàn)出生殖系基因和X連鎖基因CGI啟動(dòng)子的低甲基化，這與DNMT3B在小鼠發(fā)育過(guò)程中靶向這些序列的結(jié)果一致91,116，這表明該靶向可能獨(dú)立于ZBTB14、CDCA7和LSH發(fā)生。ICF2、ICF3和ICF4與ICF1的區(qū)別在于，中心點(diǎn)α-衛(wèi)星重復(fù)序列和神經(jīng)基因群的低甲基化。這可能意味著ZBTB14、CDCA7和LSH在DNMT3B之外的DNMT中募集。最后，圍繞著絲粒重復(fù)的全身低甲基化是如何導(dǎo)致免疫系統(tǒng)缺陷的仍不清楚。由于胚胎死亡率和/或缺乏免疫球蛋白缺陷，小鼠ICF綜合征的模型信息不充分219,220。然而，最近一項(xiàng)對(duì)zbtb24突變斑馬魚(yú)的研究表明，胚胎發(fā)育期間的中絲粒低甲基化主要通過(guò)抑制中絲粒轉(zhuǎn)錄激活先天免疫系統(tǒng)221。這樣的動(dòng)物模型可能有助于完善我們對(duì)人類ICF病理的機(jī)制理解。

----p3-3 DNMT3A, cell growth and malignancies

DNMT3A的雜合子種系突變與早期產(chǎn)前發(fā)病的生長(zhǎng)障礙有關(guān)，生長(zhǎng)表型取決于突變的性質(zhì)(表1)。錯(cuò)義，PWWP結(jié)構(gòu)域的功能增益突變?cè)诨加行☆^畸形侏儒癥m222 -的個(gè)體中發(fā)現(xiàn)一組表現(xiàn)為身體和頭部嚴(yán)重而成比例的縮小的病理。這些是功能增益突變，它會(huì)破壞DNMT3A與H3K36me3的相互作用，并改變其染色質(zhì)結(jié)合的特異性:在攜帶突變個(gè)體的成纖維細(xì)胞和血細(xì)胞中，DNA甲基化的異位獲得在被稱為DNA甲基化谷或谷223,224的大區(qū)域中觀察到，代價(jià)是二價(jià)的H3K27me3和H3K4me3修飾，這些修飾通常是這些區(qū)域的特征，并調(diào)節(jié)重要的發(fā)育基因，例如Hox轉(zhuǎn)錄因子和形態(tài)形成基因。在小鼠中引入PWWP功能增加突變顯著重現(xiàn)了小頭畸形侏儒癥患者的體型和腦重量的減少以及異位甲基化表型222,225。相比之下，雜合子DNMT3A單倍性突變是Tatton-Brown - Rahman綜合征(TBRS;也被稱為DNMT3Aovergrowth綜合征;OMIM 602729)DNMT3A基因發(fā)生TBRS突變，包括PWWP結(jié)構(gòu)域(功能獲得突變的上游)、ADD結(jié)構(gòu)域和MTase結(jié)構(gòu)域。這些突變對(duì)DNA甲基化模式的影響尚未確定，盡管DNMT3A功能增益突變體中高甲基化的大基因組結(jié)構(gòu)域在TBRS222個(gè)體中似乎沒(méi)有受到影響。考慮到DNMT3A功能缺失導(dǎo)致小鼠各種組織中的干細(xì)胞增殖227,228,DNMT3A單倍性不足可能通過(guò)增加組織中的細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)而增加機(jī)體大小，促進(jìn)TBRS的過(guò)度生長(zhǎng)。相反，DNMT3A功能的獲得可能有利于干細(xì)胞的分化而不是增殖，進(jìn)而減少器官和身體的大小。在全基因組關(guān)聯(lián)研究中，DNMT3A位點(diǎn)與自然高度變異密切相關(guān)229，指出了DNMT3A在人類體型生理學(xué)中的重要作用。最后，體細(xì)胞DNMT3A突變與未成熟骨髓細(xì)胞的增殖增強(qiáng)和成人血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)展有關(guān)。在15-35%的急性髓系白血病(AML;OMIM 601626)，絕大多數(shù)是MTase域的精氨酸882 (R882)的錯(cuò)義突變。R882突變對(duì)野生型DNMT3A四聚體的形成有顯性的負(fù)面影響，從而在體外降低了80%的酶的甲基化活性230。因此，在AML231發(fā)病之前，CpG密集區(qū)域的特定位點(diǎn)觀察到非常集中但全基因組范圍內(nèi)的低甲基化。二價(jià)CGI啟動(dòng)子的高甲基化也有報(bào)道，但這是AML進(jìn)展的結(jié)果，而不是原因，繼發(fā)于惡性髓系細(xì)胞的快速細(xì)胞增殖。有趣的是，種系R882突變也存在，并導(dǎo)致TBRS232患者的早發(fā)性AML。

----p3-4 Hydroxymethylation by TET2 and cancer

1）雖然DNMT3A活性的體細(xì)胞喪失在AML中相當(dāng)常見(jiàn)，但TET2突變更常見(jiàn)的原因是血液系統(tǒng)惡性腫瘤
2）TET2功能的恢復(fù)可以逆轉(zhuǎn)白血病，進(jìn)一步支持該酶在疾病病因?qū)W中的致病作用。
3）5hmC修飾可能是惡性腫瘤的罪魁禍?zhǔn)住?br> 4）與DNA甲基化和去甲基化因子突變相關(guān)的疾病提供了對(duì)這些蛋白質(zhì)功能的微妙理解，超出了功能喪失研究所能實(shí)現(xiàn)的。對(duì)這些領(lǐng)域的持續(xù)研究有望帶來(lái)癌癥和遺傳疾病的治療突破。

Conclusions and future perspective

自20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)DNMT1以來(lái)，盡管在理解DNA甲基化機(jī)制和模式方面取得了重大進(jìn)展，但仍有許多未知。隨著技術(shù)的飛速發(fā)展和從不同系統(tǒng)的研究中獲得的知識(shí)，哺乳動(dòng)物DNA甲基化研究的未來(lái)有望有令人興奮和影響深遠(yuǎn)的發(fā)現(xiàn)。