文獻(xiàn)名稱(chēng): Single-cell and spatial analysis reveal interaction of FAP fibroblasts and SPP1 macrophages in colorectal cancer.Nat Commun 2022 04 01;13(1)

摘要:

大腸癌(CRC)是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，除了外科手術(shù)以外的治療手段有限。腫瘤微環(huán)境(TME)分析能夠發(fā)現(xiàn)潛在的治療靶點(diǎn)。在這里，我們分析了54,103個(gè)來(lái)自腫瘤和鄰近組織的細(xì)胞，以表征細(xì)胞組成，闡明CRC 中, 腫瘤富集細(xì)胞類(lèi)型潛在起源和調(diào)控規(guī)律。我們證明腫瘤特異性 FAP 成纖維細(xì)胞和 SPP1巨噬細(xì)胞在包含2550個(gè)樣品的14個(gè)獨(dú)立 CRC 隊(duì)列中呈正相關(guān)，并通過(guò)免疫熒光染色和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)驗(yàn)證其密切定位。這種相互作用可能受到化學(xué)蛋白、 TGF-β 和白細(xì)胞介素 -1的調(diào)節(jié)，從而刺激免疫排斥結(jié)締組織的形成，限制 T 細(xì)胞的浸潤(rùn)。此外，我們發(fā)現(xiàn) FAP 或 SPP1高表達(dá)的患者從抗 PD-L1治療隊(duì)列中獲得較少的治療益處。我們的研究結(jié)果提供了一個(gè)潛在的治療策略，通過(guò)破壞 FAP 成纖維細(xì)胞和 SPP1巨噬細(xì)胞的相互作用來(lái)改善免疫治療。

背景:

結(jié)直腸癌（CRC）是第三大最常見(jiàn)的惡性腫瘤（僅次于肺癌和乳腺癌），每年導(dǎo)致全球約80萬(wàn)人死亡。最近，繼在以前難以治療的實(shí)體瘤（如黑色素瘤和肺癌）中取得成功之后，免疫檢查點(diǎn)阻滯（ICB）策略被應(yīng)用于CRC治療。許多研究都探索了T細(xì)胞有效抗腫瘤的免疫療法. 然而，PD-1靶向抗體(新型治療癌癥的藥物)僅對(duì)具有高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI-H）的錯(cuò)配修復(fù)缺陷腫瘤有效，錯(cuò)配修復(fù)缺陷腫瘤僅占轉(zhuǎn)移性CRC病例的<5% . 因此，有必要了解CRC腫瘤微環(huán)境（TME）中細(xì)胞和分子重塑的機(jī)制，并找到潛在的干預(yù)靶點(diǎn)，以提高免疫治療的治療效果。最近的研究表明，基質(zhì)細(xì)胞和髓系細(xì)胞可能形成腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的獨(dú)特生態(tài)位。使它們成為潛在的治療靶點(diǎn)。

間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞代表非上皮、非造血細(xì)胞成分，對(duì)組織重塑、炎癥反應(yīng)、上皮細(xì)胞生長(zhǎng)和免疫抑制至關(guān)重要. 雖然缺乏典型的譜系標(biāo)志物，但它們對(duì)活蛋白、膠原蛋白、PDGFRα/β和吡蟲(chóng)素呈陽(yáng)性，在組織和細(xì)胞類(lèi)型之間具有不同的分布模式。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的最新進(jìn)展使得結(jié)直腸疾病（包括炎癥性腸?。┠軌蛞郧八从械姆直媛蕦?duì)細(xì)胞群進(jìn)行系統(tǒng)分析。基質(zhì)細(xì)胞的異質(zhì)性也被認(rèn)為與CRC進(jìn)展的結(jié)果有關(guān).

最近有報(bào)道稱(chēng)，從TME中排除浸潤(rùn)免疫細(xì)胞與CRC患者的預(yù)后不良有關(guān)。并且已經(jīng)建議將腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）定位在腫瘤邊緣以防止細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞（CTL）浸潤(rùn)到腫瘤核心. 據(jù)報(bào)道，兩種類(lèi)型的TAMs具有不同的炎癥和血管生成特征，并且對(duì)CSF1R阻斷治療的反應(yīng)相反. 其他研究還報(bào)告了表達(dá)M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物（例如CD163，DC-SIGN）的巨噬細(xì)胞或表達(dá)FSP1，F(xiàn)AP的癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞之間的正相關(guān)相關(guān)性，以及CRC患者的不良結(jié)局. 最近報(bào)道了一種具有獨(dú)特特征的TAM亞型，稱(chēng)為SPP1巨噬細(xì)胞，具有免疫抑制特性，并與EMT標(biāo)志物呈正相關(guān)，作為抗腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的潛在靶標(biāo)。然而，骨髓細(xì)胞與CRC TME中其他類(lèi)型的細(xì)胞之間的相互作用尚未得到充分研究。

結(jié)果:

1. 人正常黏膜和結(jié)直腸癌組織的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜

(5名非轉(zhuǎn)移性患者)腫瘤樣品和鄰近正常組織（結(jié)腸腺癌（COAD），n = 2; 直腸腺癌（READ），n = 3）

去批次: Harmony

Fig. 1: Single-cell Atlas of paired human normal mucosa and CRC tissues.

2. 結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中細(xì)胞群的特征揭示了 TME 的標(biāo)志性特征和對(duì)臨床結(jié)果的預(yù)測(cè)

為了研究腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞亞群調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的變化，我們利用分子特征數(shù)據(jù)庫(kù)（MsigDB）的標(biāo)志性基因集。分析MSCs，EC，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，髓細(xì)胞，T細(xì)胞和B細(xì)胞在相鄰正常組織和腫瘤組織之間的途徑變化（圖2a）。免疫相關(guān)途徑，包括炎癥反應(yīng)，IL2 / STAT5信號(hào)傳導(dǎo)和IL6 / JAK / STAT3信號(hào)傳導(dǎo)，不僅在免疫細(xì)胞群（如骨髓細(xì)胞和T / ILC細(xì)胞）中富集，而且與正常組織相比，在腫瘤中的MSCs和EC中也富集（圖2a），這表明MSCs和EC參與對(duì)結(jié)直腸癌的免疫反應(yīng)。缺氧的標(biāo)志性基因集在腫瘤的MSCs，EC和骨髓細(xì)胞中比正常樣品的更豐富（圖2a）。這些特征可能反映了定位于腫瘤缺氧區(qū)域的基質(zhì)細(xì)胞相互作用，該區(qū)域?qū)⒕奘杉?xì)胞，間充質(zhì)細(xì)胞和EC連接起來(lái)以重塑CRC微環(huán)境。此外，腫瘤浸潤(rùn)骨髓細(xì)胞和T/ILC表現(xiàn)出比正常粘膜細(xì)胞更大的代謝相關(guān)基因富集，包括脂肪酸代謝、異種生物代謝、膽汁酸代謝和膽固醇穩(wěn)態(tài)（圖2a），這表明免疫代謝在CRC TME中被重新編程。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明主要細(xì)胞類(lèi)型的調(diào)節(jié)途徑在CRC TME中形成。

由于我們的scRNA-seq數(shù)據(jù)集的樣本量有限，我們使用了反卷積算法CIBERSORTx模擬細(xì)胞類(lèi)型特異性基因表達(dá)譜，以預(yù)測(cè)由scRNA-seq定量的每種細(xì)胞類(lèi)型的豐度，這些細(xì)胞類(lèi)型來(lái)自癌癥基因組圖譜（TCGA）的COAD和READ隊(duì)列以及來(lái)自基因表達(dá)綜合（GEO）的12個(gè)獨(dú)立CRC隊(duì)列的大規(guī)模數(shù)據(jù)集中。CIBERSORTx在預(yù)測(cè)TCGA和GEO數(shù)據(jù)集的細(xì)胞類(lèi)型特異性基因表達(dá)譜方面的魯棒性是使用我們自己的scRNA-seq數(shù)據(jù)集訓(xùn)練的. 為了確定CRC微環(huán)境中不同細(xì)胞群之間的關(guān)系，我們分析了14個(gè)獨(dú)立CRC隊(duì)列中九種主要細(xì)胞類(lèi)型浸潤(rùn)模式中的成對(duì)Spearman相關(guān)性。觀察到MSCs與骨髓細(xì)胞之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系（Spearman相關(guān)系數(shù)[|Rs|]>0.3和假發(fā)現(xiàn)率[FDR]<0.05）被認(rèn)為是顯著相關(guān)的，Rs范圍從GSE18105數(shù)據(jù)集中的0.47到GSE17537數(shù)據(jù)集中55個(gè)CRC樣本的0.76（圖2b，c）。

為了評(píng)估CRC TME中每種細(xì)胞類(lèi)型浸潤(rùn)的臨床相關(guān)性，我們研究了細(xì)胞型浸潤(rùn)與CRC患者總生存期（OS）和無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）的相關(guān)性。(中位值區(qū)分浸潤(rùn)高低)這些分析顯示，TCGA CRC隊(duì)列（圖2d，e）中MSC浸潤(rùn)較高的CRC患者與較差的OS（對(duì)數(shù)等級(jí)測(cè)試，p = 0.02）和PFS（對(duì)數(shù)等級(jí)測(cè)試，p = 0.00071）相關(guān)。這與先前報(bào)道的間充質(zhì)型結(jié)直腸癌的結(jié)果一致。此外，骨髓細(xì)胞的更大浸潤(rùn)也與較差的OS（對(duì)數(shù)秩測(cè)試，p = 0.026）和PFS（對(duì)數(shù)排列測(cè)試，p = 0.033; 圖2d，e）有關(guān)。此外，我們發(fā)現(xiàn)MSCs浸潤(rùn)與TME中骨髓細(xì)胞浸潤(rùn)呈正相關(guān)（圖2b，c），MSCs和髓細(xì)胞在CMS4型CRC中均富集（補(bǔ)充圖2i，j）。

部分內(nèi)容注釋:

總生存期(OS): 從隨機(jī)化分組開(kāi)始，至因任何原因引起死亡的時(shí)間。對(duì)于死亡之前就已經(jīng)失訪的受試者，通常將最后一次隨訪時(shí)間計(jì)算為死亡時(shí)間。

無(wú)進(jìn)展生存期(PFS, Progression-Free-Survival): 從隨機(jī)化到病人出現(xiàn)腫瘤進(jìn)展或死亡的時(shí)間。

至腫瘤進(jìn)展時(shí)間(TTP, Time-to-Progression): 從隨機(jī)化到病人出現(xiàn)腫瘤進(jìn)展的時(shí)間。

Fig. 2: MSCs and myeloid cells are positively correlated in tumor infiltration and associated with the clinical outcome.

Fig S1 細(xì)胞類(lèi)型圖譜

3. 腫瘤特異性FAP成纖維細(xì)胞與結(jié)直腸癌進(jìn)展有關(guān)

長(zhǎng)期以來(lái)，間充質(zhì)干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞一直被認(rèn)為是一種關(guān)鍵的基質(zhì)細(xì)胞類(lèi)型，參與調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生和癌癥進(jìn)展。

缺氧是TME最重要的特征之一，之前的一項(xiàng)研究表明，TWIST1可能受到缺氧的調(diào)節(jié)。事實(shí)上，與其他MSC亞型相比，缺氧依賴(lài)性HIF-1α信號(hào)通路在FAP成纖維細(xì)胞中顯著富集.

Fig. 3: Characterization of stromal cells in normal mucosa and tumor tissue.

為什么關(guān)注HI1α信號(hào)通路?

為了了解FAP成纖維細(xì)胞與其兩個(gè)潛在前體的分化受到調(diào)控，我們分析了差異表達(dá)的基因并進(jìn)行了KEGG富集分析（補(bǔ)充圖4g-j）。除上述TWIST1外，與FGFR2成纖維細(xì)胞和ICAM1端粒細(xì)胞相比，F(xiàn)AP成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出更高的PRRX1表達(dá)（補(bǔ)充圖4g，h），這對(duì)于調(diào)整癌癥中與癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞活化和可塑性至關(guān)重要。此外，與ICAM1端粒細(xì)胞相比，F(xiàn)AP成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出FAP，IGFBP4（編碼生長(zhǎng)因子），F(xiàn)N1（編碼細(xì)胞外基質(zhì)的糖蛋白）和HES4（對(duì)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合和蛋白質(zhì)二聚化很重要）的顯著表達(dá)（補(bǔ)充圖4h）。此外，與FGFR2成纖維細(xì)胞或ICAM1端粒細(xì)胞相比，F(xiàn)AP成纖維細(xì)胞在ECM受體相互作用和局灶性粘附相關(guān)途徑中富集（補(bǔ)充圖4i，j），這意味著這些細(xì)胞參與ECM形成。我們進(jìn)一步證明，與所有其他MSC亞型相比，F(xiàn)AP成纖維細(xì)胞中高度表達(dá)的基因主要是參與ECM受體相互作用，TNF信號(hào)通路和脂肪酸生物合成的基因，這表明這些過(guò)程的激活參與FAP成纖維細(xì)胞的承諾（補(bǔ)充圖4k）。

圖S2

部分內(nèi)容注釋:

ECM: 細(xì)胞外基質(zhì), 由細(xì)胞分泌到細(xì)胞外間質(zhì)中的大分子物質(zhì)，構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，支持并連接組織結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)組織的發(fā)生和細(xì)胞的生理活動(dòng)。學(xué)者們一致認(rèn)為惡性腫瘤的侵蝕、轉(zhuǎn)移是一個(gè)動(dòng)態(tài)的、連續(xù)的過(guò)程。腫瘤細(xì)胞首先從原發(fā)部位脫落，侵入到細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular ma-trix,ECM），與基底膜（basement membrane,BM）及細(xì)胞間質(zhì)中一些分子粘附，并激活細(xì)胞合成、分泌各種降解酶類(lèi)，協(xié)助腫瘤細(xì)胞穿過(guò)ECM進(jìn)入血管，然后在某些因子等的作用下運(yùn)行并穿過(guò)血管壁外滲到繼發(fā)部位，繼續(xù)增殖、形成轉(zhuǎn)移灶。總之，脫落、粘附、降解、移動(dòng)和增生貫穿于惡性腫瘤侵蝕、轉(zhuǎn)移的全過(guò)程。

4. 腫瘤特異性SPP1巨噬細(xì)胞與CRC進(jìn)展相關(guān)

我們研究了鄰近組織和腫瘤組織中骨髓細(xì)胞亞型的改變，表明巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞群主要存在于腫瘤組織中，而DC在相鄰的正常組織中富集（圖4a，b）。重要的是，SPP1巨噬細(xì)胞是腫瘤特異性巨噬細(xì)胞，占腫瘤樣本中骨髓細(xì)胞的11.6%，但僅占鄰近正常組織中骨髓細(xì)胞的0.68%（圖4c）。CRC中的SPP1巨噬細(xì)胞表達(dá)通常與巨噬細(xì)胞極化相關(guān)的C1QC，MRC1，STAT1和PPARG（補(bǔ)充數(shù)據(jù)2）標(biāo)志物。與這些結(jié)果一致，當(dāng)CIBERSORTx推插細(xì)胞浸潤(rùn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)腫瘤樣品中SPP1巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)與TCGA隊(duì)列中的相鄰正常組織相比顯著上調(diào)。在TCGA和GSE17536 CRC隊(duì)列中，SPP1巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)較高的CRC患者表現(xiàn)出較短的PFS（圖4e，補(bǔ)充圖6c），并且浸潤(rùn)與TCGA CRC隊(duì)列中的晚期癌癥和MSI-H患者相關(guān)。基于對(duì)骨髓細(xì)胞亞群標(biāo)志物CD14、CD206（由MRC1編碼）、CD209和CD13（由ANPEP編碼）（圖4f）的流式細(xì)胞術(shù)分析，我們進(jìn)一步記錄到，與非惡性結(jié)腸組織相比，SPP1巨噬細(xì)胞在CRC中顯著增加，而THBS1巨噬細(xì)胞變化不顯著（圖4g).此外，RNA速度預(yù)測(cè)腫瘤特異性SPP1巨噬細(xì)胞可能起源于THBS1巨噬細(xì)胞（圖4h）。SPP1巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出更高的表達(dá)編碼鈣和鋅結(jié)合蛋白的基因，包括S100A10，S100A8和S100A6，以及與細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)的基因，如CD44（補(bǔ)充圖6g）。此外，SPP1巨噬細(xì)胞可能受到IL-17信號(hào)通路，HIF-1信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞因子 - 細(xì)胞因子受體相互作用的調(diào)節(jié)，而THBS1巨噬細(xì)胞能夠執(zhí)行抗原處理和呈遞，并調(diào)節(jié)腸道免疫網(wǎng)絡(luò)以產(chǎn)生IgA（補(bǔ)充圖6h），這意味著SPP1巨噬細(xì)胞和THBS1巨噬細(xì)胞在TME中執(zhí)行不同的功能。

為了進(jìn)一步確定SPP1巨噬細(xì)胞的主調(diào)節(jié)劑，我們進(jìn)行了pySCENIC分析。結(jié)果表明，編碼主轉(zhuǎn)錄因子的STAT1使巨噬細(xì)胞偏向小鼠M1表型，在SPP1巨噬細(xì)胞中具有高活性（圖 4i–l）。

Fig. 4: Characterization of myeloid cells in normal mucosa and tumor tissue.

在SPP1巨噬細(xì)胞中高度表達(dá)的基因是那些參與ECM-受體相互作用，PPAR信號(hào)通路和糖酵解/糖異生（補(bǔ)充圖6i） 的基因。有趣的是，SPP1巨噬細(xì)胞也可能受到HIF-1信號(hào)通路（補(bǔ)充圖6h，i）的調(diào)節(jié)，這是典型的缺氧誘導(dǎo)途徑。這些發(fā)現(xiàn)表明，這些信號(hào)通路的激活與SPP1巨噬細(xì)胞的承諾有關(guān)。由于FAP成纖維細(xì)胞和SPP1巨噬細(xì)胞與缺氧誘導(dǎo)的途徑密切相關(guān)，我們假設(shè)存在位于腫瘤缺氧區(qū)域的基質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)連接巨噬細(xì)胞和MSC，它們協(xié)同工作以加劇CRC微環(huán)境。

Fig S3

5. FAP 成纖維細(xì)胞和 SPP1 巨噬細(xì)胞的高浸潤(rùn)與較差的患者生存率相關(guān)

FAP成纖維細(xì)胞和SPP1巨噬細(xì)胞大多在腫瘤組織中富集（圖3b和4b），并且在14個(gè)結(jié)直腸癌數(shù)據(jù)集的患者中發(fā)現(xiàn)MSCs和髓細(xì)胞浸潤(rùn)之間的高度相關(guān)性（圖2b）.為了研究這些亞群的浸潤(rùn)狀態(tài)，我們使用CIBERSORTx來(lái)評(píng)估14個(gè)獨(dú)立CRC隊(duì)列中由scRNA-seq鑒定的58個(gè)細(xì)胞簇的浸潤(rùn)，并進(jìn)一步計(jì)算每個(gè)隊(duì)列中這些細(xì)胞簇浸潤(rùn)內(nèi)的成對(duì)Spearman相關(guān)性（圖5a）。我們發(fā)現(xiàn)FAP成纖維細(xì)胞和SPP1巨噬細(xì)胞是所有檢查隊(duì)列中相關(guān)性最高的群體（圖5a，補(bǔ)充圖7）。為了進(jìn)一步揭示這兩種細(xì)胞類(lèi)型之間如此緊密相關(guān)的臨床意義，我們比較了具有不同水平FAP成纖維細(xì)胞和SPP1巨噬細(xì)胞的患者的PFS。與特征組合組相比，同時(shí)具有高FAP成纖維細(xì)胞和SPP1巨噬細(xì)胞的患者表現(xiàn)出最短的PFS，這表明這兩種細(xì)胞類(lèi)型可以協(xié)同促進(jìn)腫瘤進(jìn)展（圖5b）。

為了進(jìn)一步了解誘導(dǎo)FAP成纖維細(xì)胞和SPP1巨噬細(xì)胞的潛在觸發(fā)因素或下游信號(hào)，我們計(jì)算了FAP成纖維細(xì)胞之間的差異表達(dá)基因。高 SPP1 巨噬細(xì)胞和高 FAP 成纖維細(xì)胞, 低 SPP1 巨噬細(xì)胞, 低TCGA-COAD隊(duì)列中的組，隨后進(jìn)行GSEA分析。在FAP成纖維細(xì)胞樣品中上調(diào)的基因+高 SPP1 巨噬細(xì)胞+高顯示上皮 - 間充質(zhì)過(guò)渡特征的富集（圖5c）。這些樣品還顯示出高度富集的缺氧基因集（圖5c），這與腫瘤的缺氧環(huán)境一致。53.此外，TNFα信號(hào)傳導(dǎo)和IL2/STAT5信號(hào)通路在FAP成纖維細(xì)胞中也得到了豐富的豐富。+高 SPP1 巨噬細(xì)胞+高腫瘤樣品（圖5c）。這些發(fā)現(xiàn)表明，F(xiàn)AP成纖維細(xì)胞和SPP1巨噬細(xì)胞對(duì)CRCTME內(nèi)的不同刺激和信號(hào)作出反應(yīng)。然后，我們通過(guò)H評(píng)分系統(tǒng)評(píng)估了78名CRC患者組織微陣列（TMA）中的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，以鑒定FAP和SPP1與相鄰正常組織相比在腫瘤組織中特異性增加（圖5d，e），并發(fā)現(xiàn)在該TMA隊(duì)列中FAP或SPP1蛋白水平高的患者表現(xiàn)出較短的OS（圖5f， 此外，與FAP或SPP1水平較低的患者相比，F(xiàn)AP和SPP1蛋白水平高的患者存活率較差（圖5h）。此外，TMA數(shù)據(jù)集中沒(méi)有一個(gè)患者表現(xiàn)出高水平的SPP1，但FAP較低，這可能是由于我們的樣本量相對(duì)較小，只有78個(gè)人。我們進(jìn)一步研究了FAP成纖維細(xì)胞和SPP1巨噬細(xì)胞是否緊密定位在CRC組織中。免疫熒光標(biāo)記表明CRC組織中SPP1陽(yáng)性和FAP陽(yáng)性細(xì)胞非常接近（圖5I，j），這意味著這兩個(gè)細(xì)胞之間存在潛在的串?dāng)_。

Fig. 5: High infiltration of?FAP+?fibroblasts and?SPP1+?macrophages associated with worse patient survival and immunotherapy resistance.

6. 空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示FAP成纖維細(xì)胞和SPP1巨噬細(xì)胞的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用

基于無(wú)偏倚聚類(lèi)和斑點(diǎn)特征，我們將斑點(diǎn)分為10個(gè)簇，F(xiàn)AP成纖維細(xì)胞/ SPP1巨噬細(xì)胞，惡性上皮細(xì)胞，上皮細(xì)胞，MSCs，纖維化的MT細(xì)胞，F(xiàn)AP成纖維細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，免疫細(xì)胞和6號(hào)患者的未知（圖6a-c）。來(lái)自scRNA-seq數(shù)據(jù)（前25個(gè)特異性表達(dá)的基因）中FAP成纖維細(xì)胞或SPP1巨噬細(xì)胞特征的每個(gè)簇中的評(píng)分點(diǎn)突出顯示了FAP成纖維細(xì)胞和SPP1巨噬細(xì)胞在同一位置共定位的簇（圖6g，h和補(bǔ)充圖9g-m）并包裹在惡性上皮細(xì)胞周?chē)▓D6i）。此外，F(xiàn)AP成纖維細(xì)胞或SPP1巨噬細(xì)胞的特征評(píng)分顯示出顯著的正相關(guān)（圖6j，k和補(bǔ)充圖9n-o）。大多數(shù)FAP成纖維細(xì)胞和SPP1巨噬細(xì)胞在同一位置共定位，10x Genomics Visium平臺(tái)中的一個(gè)斑點(diǎn)可以容納多達(dá)10個(gè)細(xì)胞，這表明兩種細(xì)胞類(lèi)型之間存在物理相互作用。此外，我們發(fā)現(xiàn)FAP成纖維細(xì)胞和SPP1巨噬細(xì)胞在四個(gè)ST數(shù)據(jù)集中有助于形成促成形結(jié)構(gòu)的途徑中具有高活性的斑點(diǎn)，包括細(xì)胞外基質(zhì)組織，膠原纖維組織和對(duì)TGF-β的反應(yīng)（圖6l）。從腫瘤核心中排除T細(xì)胞或B細(xì)胞（圖6m，補(bǔ)充圖9p–r）。這些結(jié)果表明，促濕性微環(huán)境可能受到FAP成纖維細(xì)胞和SPP1巨噬細(xì)胞相互作用的調(diào)節(jié)，以限制免疫細(xì)胞向腫瘤核心的浸潤(rùn)。

Fig. 6: Co-localization of?FAP+?fibroblasts and?SPP1+?macrophages revealed by spatial transcriptomics.

7. FAP成纖維細(xì)胞和SPP1巨噬細(xì)胞相互作用可能有助于腫瘤微環(huán)境的脫皮(細(xì)胞重塑分析)

為了進(jìn)一步確定CRC患者中FAP成纖維細(xì)胞和SPP1巨噬細(xì)胞相互作用的關(guān)鍵介質(zhì)，我們研究了FAP成纖維細(xì)胞和SPP1巨噬細(xì)胞的細(xì)胞 - 細(xì)胞通訊機(jī)制。為此，我們根據(jù)配體- 受體對(duì)的表達(dá)和下游靶標(biāo)，用R包“NicheNet”評(píng)估了推定的串?dāng)_。我們發(fā)現(xiàn)FAP成纖維細(xì)胞可以通過(guò)粘附配體 - 受體對(duì)COL1A1 / LAMA1 - ITGB1直接與SPP1巨噬細(xì)胞接觸（圖7a）。此外，F(xiàn)AP成纖維細(xì)胞通過(guò)表達(dá)TGF-β超家族基因TGFB1和INHBA以及TGF-β誘導(dǎo)的ACVRL1，ACVR1或ACVR1B在SPP1巨噬細(xì)胞中的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)SPP1巨噬細(xì)胞的促炎活性（圖7a）。 此外，F(xiàn)AP成纖維細(xì)胞通過(guò)WNT5A-FZD2和CCL3-CCR5對(duì)增強(qiáng)了SPP1巨噬細(xì)胞的募集。值得注意的是，F(xiàn)AP成纖維細(xì)胞通過(guò)RARRES2-CMKLR1與SPP1巨噬細(xì)胞相互作用（圖7a）。我們進(jìn)一步測(cè)定了RARRES2在MSC簇中的相對(duì)表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)該基因在FAP成纖維細(xì)胞中的表達(dá)水平高于其他MSC簇（圖7b）。由RARRES2編碼的Chemerin被證明是CRC的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，并且能夠在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中影響巨噬細(xì)胞極化.此外，編碼趨血素受體的CMKLR1在THBS1巨噬細(xì)胞和SPP1巨噬細(xì)胞中均表現(xiàn)出更高的表達(dá)（圖7c）。由于RNA“速度”分析表明SPP1巨噬細(xì)胞可以與THBS1巨噬細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)（圖4e），F(xiàn)AP成纖維細(xì)胞可能起到驅(qū)動(dòng)作用，通過(guò)趨血素促進(jìn)SPP1巨噬細(xì)胞分化。此外，我們發(fā)現(xiàn)CRC患者血漿中的趨血素水平顯著高于健康供體（圖7d），這表明化合素可以作為CRC的預(yù)測(cè)標(biāo)志物。(該段涉及大量病理, 需更多的背景積累與詳細(xì)解讀)

成纖維細(xì)胞是細(xì)胞外成分的主要生產(chǎn)者，包括細(xì)胞外基質(zhì)成分，可能有助于形成促成形結(jié)構(gòu)。64.細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）相關(guān)途徑的基因在FAP成纖維細(xì)胞和SPP1巨噬細(xì)胞中高度表達(dá)，表明FAP成纖維細(xì)胞或SPP1巨噬細(xì)胞可能有助于促成形結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生（補(bǔ)充圖4f和6g）。因此，我們研究了SPP1巨噬細(xì)胞是否促進(jìn)FAP成纖維細(xì)胞的ECM重塑能力。NicheNet分析顯示，SPP1巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出較高的TGFB1，IL1B和IL1A配體活性以及相對(duì)較高的TGFB1，IL1B和IL1A基因表達(dá)（圖7e，f）。此外，編碼TGFB1的蛋白質(zhì)與FAP成纖維細(xì)胞上由TGFBR3，ACVRL1和TGFBR1編碼的受體結(jié)合，而由IL1B或IL1A編碼的配體與FAP成纖維細(xì)胞上由IL1R1或IL1RAP編碼的受體相互作用（圖7g），導(dǎo)致這些細(xì)胞中編碼膠原或基質(zhì)金屬肽酶的靶基因的表達(dá)（圖7h）。這些靶點(diǎn)是促癌反應(yīng)的重要組成部分，100個(gè)預(yù)測(cè)靶標(biāo)中有35個(gè)編碼了ECM途徑的成分。包括細(xì)胞外生態(tài)位纖維成分（例如，膠原蛋白[由COL10A1，COL11A1，COL1A1，COL1A1，COL3A1，COL5A1，COL8A1]，纖連蛋白[由FN1編碼]和整合素[由ITGA5，ITGB5編碼]），重塑蛋白（例如，賴(lài)氨酰氧化酶家族[由LOX，LOXL1，LOXL2編碼]）和基質(zhì)金屬蛋白酶（編碼 ADAM17， MMP1， MMP14， MMP2， MMP3， TIMP1， TIMP2， TIMP3） （圖7h）.我們進(jìn)一步對(duì)KEGG途徑和細(xì)胞外基質(zhì)的基因集進(jìn)行了NicheNet配體活性分析。事實(shí)上，靶基因很有可能屬于細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、細(xì)胞外基質(zhì)途徑、TNF信號(hào)通路和TGF-β信號(hào)通路（圖7i）。我們進(jìn)一步探索了前三個(gè)配體（由TGFB1，IL1A和IL1B編碼）和ECM相關(guān)靶標(biāo)之間的信號(hào)通路，我們發(fā)現(xiàn)了40個(gè)下游調(diào)節(jié)劑，包括HIF1A，AKT1，STAT1和NFKB1，它們參與信號(hào)通路連接SPP1巨噬細(xì)胞分泌的配體和有助于形成促癌區(qū)域的ECM靶基因（圖7j）。綜上所述，我們的研究結(jié)果表明，F(xiàn)AP成纖維細(xì)胞和SPP1巨噬細(xì)胞形成一個(gè)相互作用網(wǎng)絡(luò)，支持彼此的維持和功能。這兩種細(xì)胞類(lèi)型可能在ECM的重塑中發(fā)揮重要作用，可能促進(jìn)TME的促成膜增生區(qū)域的形成。

Fig. 7: The interaction network between?FAP+?fibroblasts and?SPP1+?macrophages.

8. FAP成纖維細(xì)胞和SPP1巨噬細(xì)胞的高浸潤(rùn)與免疫治療耐藥性相關(guān)

腫瘤免疫微環(huán)境一般可分為免疫排除型、發(fā)炎型（簡(jiǎn)稱(chēng)“熱”型腫瘤，對(duì)免疫療法反應(yīng)良好）和CD8 T細(xì)胞浸潤(rùn)的免疫荒漠型。因此，我們對(duì)FAP成纖維細(xì)胞和/或SPP1巨噬細(xì)胞不同浸潤(rùn)模式的腫瘤的局部免疫特征感到好奇。有趣的是，CRC腫瘤樣本中FAP成纖維細(xì)胞高 SPP1 巨噬細(xì)胞高組顯示非沉默突變和單核苷酸變異（SNV）預(yù)測(cè)的新抗原發(fā)生率相對(duì)較高。此外，它們顯示出更高的Shannon 熵指數(shù)和TCR豐富度，反映了T細(xì)胞對(duì)新抗原的非有效反應(yīng)（圖8a-d）。在所有CRC亞型中，這種CRC亞型也顯示出最低的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（圖8e），這表明這種特定類(lèi)型腫瘤的微環(huán)境特征是免疫排斥的，F(xiàn)AP成纖維細(xì)胞和SPP1巨噬細(xì)胞都具有高浸潤(rùn)性。目前的腫瘤免疫療法主要針對(duì)淋巴細(xì)胞，因此，減少這類(lèi)腫瘤的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)會(huì)抑制免疫療法的效果。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們使用IMvigor210數(shù)據(jù)集對(duì)接受抗PD-L1治療的膀胱癌患者的生存時(shí)間和FAP或SPP1表達(dá)進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。FAP或SPP1表達(dá)水平高的患者對(duì)PD-L1抗體治療的反應(yīng)顯示OS受損（圖8f，g）。此外，F(xiàn)AP和SPP1表達(dá)水平高的抗PD-L1治療患者顯示出較短的生存時(shí)間（圖8h）。重要的是，與 FAP 和 SPP1 均表達(dá)水平較低的患者相比，F(xiàn)AP 或 SPP1 水平較高的患者表現(xiàn)出較低的反應(yīng)（完全緩解 [CR] 和部分反應(yīng) [PR]），但進(jìn)展性疾病 （PD） 更為進(jìn)行性（PD）（圖 8i），這表明富含 FAP 或 SPP1 的患者對(duì)抗 PD-L1 治療的反應(yīng)明顯較差。

Fig. 8: The infiltration of lymphocytes in TME and response to PD-L1 blockade in patients affected by?SPP1+?macrophages and?FAP+?fibroblasts.

結(jié)論

這些發(fā)現(xiàn)意味著FAP成纖維細(xì)胞和SPP1巨噬細(xì)胞有助于ECM重塑和協(xié)調(diào)，形成一個(gè)可塑性的微環(huán)境，防止淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)腫瘤核心，進(jìn)一步降低PD-L1治療的療效（圖8j）。我們提出，從機(jī)械上講，F(xiàn)AP成纖維細(xì)胞受TWIST1調(diào)節(jié)，其表達(dá)由缺氧誘導(dǎo);它們還分泌趨血素，趨血素可以進(jìn)入血管并與THBS1巨噬細(xì)胞結(jié)合，這可能分化為SPP1巨噬細(xì)胞。此外，SPP1巨噬細(xì)胞可能通過(guò)TGFB1調(diào)節(jié)FAP成纖維細(xì)胞，從而促進(jìn)MMPs和膠原蛋白的分泌，它們共同促進(jìn)ECM的重塑（圖8j）。生物相互作用機(jī)制仍需在今后的工作中加以處理。我們的研究揭示了CRC微環(huán)境中免疫和非免疫細(xì)胞的詳細(xì)景觀，并強(qiáng)調(diào)了識(shí)別和開(kāi)發(fā)針對(duì)FAP成纖維細(xì)胞，SPP1巨噬細(xì)胞或參與其串?dāng)_的分子的治療策略以克服免疫抑制并增加腫瘤對(duì)免疫療法的反應(yīng)的潛在價(jià)值。

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