注：轉(zhuǎn)自一位師兄的個(gè)人網(wǎng)站（王進(jìn)的個(gè)人網(wǎng)站），我覺(jué)得寫的挺好挺清楚的，所以直接引用了。（如有侵權(quán)，請(qǐng)聯(lián)系撤回）
CRISPR/Cas技術(shù)是什么？
CRISPR/Cas系統(tǒng)是一種原核生物的免疫系統(tǒng)，用來(lái)抵抗外源遺傳物質(zhì)的入侵，比如噬菌體病毒和外源質(zhì)粒。同時(shí)，它為細(xì)菌提供了獲得性免疫：這與哺乳動(dòng)物的二次免疫類似，當(dāng)細(xì)菌遭受病毒或者外源質(zhì)粒入侵時(shí)，會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的“記憶”，從而可以抵抗它們的再次入侵。CRISPR/Cas系統(tǒng)可以識(shí)別出外源DNA，并將它們切斷，沉默外源基因的表達(dá)。這與真核生物中RNA干擾（RNAi)的原理是相似的。正是由于這種精確的靶向功能，CRISPR/Cas系統(tǒng)被開(kāi)發(fā)成一種高效的基因編輯工具。在自然界中，CRISPR/Cas系統(tǒng)擁有多種類別，其中CRISPR/Cas9系統(tǒng)是研究最深入，應(yīng)用最成熟的一種類別。CRISPR/Cas9是繼鋅指核酸內(nèi)切酶（ZFN）”、“類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALEN）”之后出現(xiàn)的第三代“基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)”。憑借著成本低廉，操作方便，效率高等優(yōu)點(diǎn)，CRISPR/Cas9迅速風(fēng)靡全球的實(shí)驗(yàn)室，成為了生物科研的有力幫手。在TALEN和ZFN的時(shí)代，科學(xué)家們往往要花費(fèi)重金，把基因編輯工作交給生物公司。而現(xiàn)在，在實(shí)驗(yàn)室里，人們就可以使用CRISPR/Cas9技術(shù)輕松的實(shí)現(xiàn)基因編輯。
CRISPR/Cas9如何工作？
CRISPR簇是一個(gè)廣泛存在于細(xì)菌和古生菌基因組中的特殊DNA重復(fù)序列家族，充當(dāng)了防御外源遺傳物質(zhì)的“基因武器”。CRISPR全稱Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats—成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列，分布在40%的已測(cè)序細(xì)菌和90%的已測(cè)序古細(xì)菌當(dāng)中。圖1展示了完整的CRISPR位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)。其中，CRISPR序列由眾多短而保守的重復(fù)序列區(qū)（repeats）和間隔區(qū)（spacer）組成。重復(fù)序列區(qū)含有回文序列，可以形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。而間隔區(qū)比較特殊，它們是被細(xì)菌俘獲的外源DNA序列。這就相當(dāng)于細(xì)菌免疫系統(tǒng)的“黑名單”，當(dāng)這些外源遺傳物質(zhì)再次入侵時(shí)，CRISPR/Cas系統(tǒng)就會(huì)予以精確打擊。而在上游的前導(dǎo)區(qū)（leader）被認(rèn)為是CRISPR序列的啟動(dòng)子。另外，在上游還有一個(gè)多態(tài)性的家族基因，該基因編碼的蛋白均可與CRISPR序列區(qū)域共同發(fā)生作用。因此，該基因被命名為CRISPR關(guān)聯(lián)基因（CRISPR associated，Cas）。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了Cas1-Cas10等多種類型的Cas基因。Cas基因與CRISPR序列共同進(jìn)化，形成了在細(xì)菌中高度保守的CRISPR/Cas系統(tǒng)。
那么，CRISPR序列是如何與Cas蛋白配合來(lái)執(zhí)行防御功能的呢？整個(gè)過(guò)程大體分為3步。
1.外源DNA俘獲：“黑名單”登記
簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，CRISPR/Cas系統(tǒng)在這一步實(shí)現(xiàn)了一個(gè)“黑名單登記”功能。CRISPR/Cas系統(tǒng)將識(shí)別出入侵者的“名字”（PAM）并找到它的“身份證”（原間隔序列），然后把入侵者身份信息作為“檔案”（間隔序列）記錄到“黑名單”（CRISPR序列）中。圖2展示了第一階段的工作原理。當(dāng)噬菌體病毒首次入侵宿主細(xì)菌，病毒的雙鏈DNA被注入細(xì)胞內(nèi)部。CRISPR/Cas系統(tǒng)會(huì)從這段外源DNA中截取一段序列作為外源DNA的“身份證”，然后將其作為新的間隔序列被整合到基因組的CRISPR序列之中。因此，這段與間隔序列對(duì)應(yīng)的“身份證”被稱為原間隔序列（protospacer）。然而，“身份證”的選取并不是隨機(jī)的。原間隔序列向兩端延伸的幾個(gè)堿基都十分保守，被稱為原間隔序列臨近基序（protospacer adjacent motif，PAM）。PAM通常由NGG三個(gè)堿基構(gòu)成（N為任意堿基）。病毒入侵時(shí)，Cas1和Cas2編碼的蛋白將掃描這段外源DNA，并識(shí)別出PAM區(qū)域，然后將臨近PAM的DNA序列作為候選的原間隔序列。隨后，Cas1/2蛋白復(fù)合物將原間隔序列從外源DNA中剪切下來(lái)，并在其他酶的協(xié)助下將原間隔序列插入臨近CRISPR序列前導(dǎo)區(qū)的下游。然后，DNA會(huì)進(jìn)行修復(fù)，將打開(kāi)的雙鏈缺口閉合。這樣一來(lái)，一段新的間隔序列就被添加到了基因組的CRISPR序列之中。
2. crRNA合成：”軍火“制造
戰(zhàn)爭(zhēng)總需要武器，CRISPR/Cas系統(tǒng)也要制造足夠的”軍火“來(lái)打擊入侵者。目前的研究表明，CRISPR/Cas系統(tǒng)共有三種方式（Type Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）來(lái)制造”軍火“。CRISPR/Cas9系統(tǒng)屬于Type Ⅱ，是目前最成熟也是應(yīng)用最廣的類型。因此，圖3將重點(diǎn)介紹CRISPR/Cas9的原理。當(dāng)入侵者到來(lái)，CRISPR序列會(huì)在”指揮官“（前導(dǎo)區(qū)）的調(diào)控下轉(zhuǎn)錄出兩種“軍火材料”：pre-CRISPR-derived RNA (pre-crRNA)和trans-acting crRNA（tracrRNA）。其中，tracrRNA是由重復(fù)序列區(qū)轉(zhuǎn)錄而成的具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNA，而pre-crRNA是由整個(gè)CRISPR序列轉(zhuǎn)錄而成的大型RNA分子。隨后，pre-crRNA，tracrRNA以及Cas9編碼的蛋白將會(huì)組裝成一個(gè)小型“兵工廠”。它將根據(jù)入侵者的類型，選取對(duì)應(yīng)的“身份證”（間隔序列RNA），并在RNase Ⅲ的協(xié)助下對(duì)這段間“身份證”進(jìn)行剪切，最終形成一段短小的crRNA（包含單一種類的間隔序列RNA以及部分重復(fù)序列區(qū)）。crRNA，Cas9以及tracrRNA組成的復(fù)合物，就是最終的“戰(zhàn)斗武器”。
3.靶向干擾：強(qiáng)大火力，精確打擊
武器已經(jīng)制造完成，戰(zhàn)爭(zhēng)就要打響。圖4展示了靶向干擾的過(guò)程。Cas9/tracrRNA/crRNA復(fù)合物就像是一枚制導(dǎo)導(dǎo)彈，可以對(duì)入侵者的DNA進(jìn)行精確的打擊。這個(gè)復(fù)合物將掃描整個(gè)外源DNA序列，并識(shí)別出與crRNA互補(bǔ)的原間隔序列。這時(shí)，復(fù)合物將定位到PAM/原間隔序列的區(qū)域，DNA雙鏈將被解開(kāi)，形成R-Loop。crRNA將與互補(bǔ)鏈雜交，而另一條鏈則保持游離狀態(tài)。隨后，Cas9蛋白發(fā)起猛烈攻勢(shì)，其HNH酶活性將剪切crRNA互補(bǔ)的DNA鏈，而其RuvC活性位點(diǎn)將剪切非互補(bǔ)鏈。最終，Cas9強(qiáng)大的火力使雙鏈斷裂（DSB）形成，外源DNA的表達(dá)被沉默，入侵者被一舉殲滅。
如何應(yīng)用CRISPR/Cas技術(shù)？
CRISPR/Cas是進(jìn)行基因編輯的強(qiáng)大工具，可以對(duì)基因進(jìn)行定點(diǎn)的精確編輯。在向?qū)NA（guide RNA，gRNA）和Cas9蛋白的參與下，待編輯的細(xì)胞基因組DNA將被看作病毒或外源DNA，被精確剪切。但是，CRISPR/Cas9的應(yīng)用也有一些限制條件。首先，待編輯的區(qū)域附近需要存在相對(duì)保守的PAM序列（NGG）。其次，向?qū)NA要與PAM上游的序列堿基互補(bǔ)配對(duì)。圖5展示了最基礎(chǔ)的兩種CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用。以基因敲除為例，在待敲除基因的上下游各設(shè)計(jì)一條向?qū)NA（向?qū)NA1，向?qū)NA2），將其與含有Cas9蛋白編碼基因的質(zhì)粒一同轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，向?qū)NA通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)可以靶向PAM附近的目標(biāo)序列，Cas9蛋白會(huì)使該基因上下游的DNA雙鏈斷裂。而生物體自身存在著DNA損傷修復(fù)的應(yīng)答機(jī)制，會(huì)將斷裂上下游兩端的序列連接起來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞中目標(biāo)基因的敲除。如果在此基礎(chǔ)上為細(xì)胞引入一個(gè)修復(fù)的模板質(zhì)粒（供體DNA分子），這樣細(xì)胞就會(huì)按照提供的模板在修復(fù)過(guò)程中引入片段插入或定點(diǎn)突變。這樣就可以實(shí)現(xiàn)基因的替換或者突變。對(duì)受精卵細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，并將其導(dǎo)入代孕母體中，可以實(shí)現(xiàn)基因編輯動(dòng)物模型的構(gòu)建。隨著研究的深入，CRISPR/Cas技術(shù)已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用。除了基因敲除，基因替換等基礎(chǔ)編輯方式，它還可以被用于基因激活，疾病模型構(gòu)建，甚至是基因治療。
