背景：單細胞VDJ的背景、原理等。
1.為什么做單細胞VDJ？
理論上生物體內(nèi)的基因組DNA是完全相同的，除了腫瘤細胞會發(fā)生頻繁的DNA突變。因此，常規(guī)的單細胞研究不用關(guān)心DNA水平的變化，只需要測序轉(zhuǎn)錄組（基因表達調(diào)控的結(jié)果）差異。
大部分細胞的基因組都完全相同，但淋巴細胞除外，淋巴細胞在發(fā)育過程中可以重排胚系基因組中的抗原受體基因，從而形成淋巴細胞豐富的抗原受體多樣性。
因此，單細胞VDJ測序的細胞對象是：淋巴細胞；
單細胞VDJ測序的目的是：研究抗原受體多樣性。
單細胞VDJ能夠檢測樣本中具體某個亞類T/B細胞的TCR/BCR多樣性變化，以及某種克隆型在各類T/B細胞中的頻率，傳統(tǒng)的VDJ只能知道樣本中TCR/BCR多樣性的總體值（要說傳統(tǒng)測序和單細胞的差別，幾乎都有：樣本vs具體細胞類型的差別）；
舉例：單細胞轉(zhuǎn)錄組僅僅基于MARKER基因?qū)細胞進行分類，但對于同一亞類的兩個Th細胞來講，盡管他們的基因表達模式相似，但攜帶的TCR不同，那么他們在免疫過程中的功能可能完全不同。
對免疫細胞同時開展5`轉(zhuǎn)錄組和VDJ測序才能最大程度地揭示T/B細胞的多樣性，以及他們在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的變化。
2.如何從基因片段理解VDJ？
2.1 BCR
BCR分為輕鏈和重鏈；
如下圖所示：
BCR輕鏈（light chain）上，V、J基因片段在個體胚系基因組上遠離，但在B細胞內(nèi)經(jīng)過重排，原來相互遠離的V和J基因區(qū)段接合產(chǎn)生了連續(xù)的外顯子，其編碼整個輕鏈V區(qū)。在轉(zhuǎn)錄后，通過RNA剪切將V區(qū)外顯子連接到C區(qū)外顯子上，構(gòu)成完整的輕鏈mRNA，進一步可以表達為輕鏈蛋白；
在重鏈(heavy chain)上，V、D、J基因在個體胚系基因組上遠離，經(jīng)過重排，D、J連接在一起形成DJ片段，然后一個V基因片段重排至DJ形成一個完整的V區(qū)外顯子。經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后，RNA剪切將V區(qū)外顯子連接到C區(qū)外顯子上，形成完整的mRNA，進一步表達為重鏈蛋白。
2.2 TCR
TCR分為α鏈和β鏈；
如下圖所示：
類似的原理，T細胞受體α鏈和β鏈由V和C區(qū)組成，TCR 的α鏈含有V和J基因片段，β鏈含有V、D、J基因片段，這些基因片段在原始的胚系基因組上有多個拷貝且彼此遠離，通過DNA重組和mRNA剪切VDJ片段被選擇和拼接為連續(xù)完整的mRNA片段，并翻譯為有具體功能的TCR蛋白。
3.如何從功能區(qū)理解VDJ？
從功能角度來看，V區(qū)片段分為CDR區(qū)和FR區(qū)。在BCR重鏈上，CDR3橫跨V區(qū)D區(qū)和J區(qū)，在輕鏈上，CDR3橫跨V區(qū)和J區(qū)；在TCRβ鏈上，CDR3橫跨V區(qū)D區(qū)和J區(qū)，在α鏈上，則橫跨V區(qū)和J區(qū)。
T/B細胞的發(fā)育成熟，除了受機體微環(huán)境的影響，還在很大程度上決定于自身攜帶的抗原受體類型。TCR/BCR克隆型與機體微環(huán)境（微環(huán)境中的細胞組成、溫度、含氧量等）持續(xù)互作，共同決定T細胞與B細胞的發(fā)育分化。
4.影響抗原多樣性的原因是什么？
多樣性的來源：
1.重組多樣性
2.高拷貝多樣性
在最初的胚系基因組中VDJ基因片段有多個拷貝，高拷貝意味著低選擇壓，這些片段具有極高的突變率和群體多樣性。
3.序列隨機刪除、引入的多樣性
4.體細胞超突變的多樣性（只發(fā)生在B細胞，不發(fā)生在T細胞）
5.10x VDJ建庫原理是什么？
這兩句話的意思是VDJ和5`轉(zhuǎn)錄組文庫來自于相同細胞的cDNA擴增，也就是說在同一個GEM內(nèi)做了逆轉(zhuǎn)錄和cDNA擴增后，才分為兩種文庫——exp文庫和VDJ文庫，因此它們的barcode標(biāo)簽相同，如下圖所示：
值得注意的是，VDJ和5`轉(zhuǎn)錄組文庫來自于相同細胞的cDNA，而蛋白受體文庫是來自于相同細胞的DNA。
Amplified full-length cDNA from poly-adenylated mRNA is used to enrich full-length V(D)J segments (10x Barcoded) via PCR amplification with primers specific to either the TCR or BCR constant regions. If both T and B cells are expected to be present in the partitioned cell population, TCR and BCR transcripts can be amplified in separate reactions from the same amplified cDNA material.
請注意，以上10x文庫原話說明可以在同一個細胞的擴增cDNA中同時做TCR和BCR。
最終文庫如下圖所示：
在下機后的VDJ數(shù)據(jù)處理中，只保留在5`轉(zhuǎn)錄組中識別為細胞的barcode，不在的則從VDJ數(shù)據(jù)中移除，如下圖所示：
