用BioID2 鄰近標記（Proximity Labeling）臨近細胞提高CO-IP效率
1. 核心工具：BioID2 是什么？
- BioID2 是一種工程化的生物素連接酶（biotin ligase），通?；诖竽c桿菌的 BirA 酶進行突變優(yōu)化（BioID2 是第二代版本，比第一代 BioID 活性更高、半徑更小、更適合活細胞使用）。
- 它被融合（fusion）到目標蛋白上（如 CASP5A 或 CASP5C），同時帶有一個 MYC 標簽方便檢測。
2. 工作原理（步步拆解）
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融合蛋白表達：
- 通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)（Lentiviral transduction） 把 CASP5-BioID2 融合基因?qū)肴祟惤Y(jié)腸類器官（human colonic organoids）中，讓類器官細胞穩(wěn)定表達這個融合蛋白。
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添加生物素（Biotin）觸發(fā)標記：
- 細胞培養(yǎng)時加入外源生物素（biotin）。
- BioID2 酶會利用 ATP 把生物素共價連接（biotinylation） 到附近蛋白的賴氨酸（Lysine）殘基上。
- 關(guān)鍵特性：標記范圍很小，通常只有 10–20 nm 半徑（相當于一個蛋白復(fù)合物的物理距離）。這意味著只有與 CASP5 直接接觸或非?？拷?/strong>的蛋白才會被標記。
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為什么能捕獲互作蛋白？
- 傳統(tǒng) Co-IP（免疫共沉淀）容易丟失瞬時、弱相互作用，且需要裂解細胞后進行。
- BioID2 是在活細胞內(nèi)（in vivo） 實時標記，能捕獲生理狀態(tài)下的瞬時或空間鄰近蛋白（包括 Dishevelled/DVL）。
- 即使相互作用很短暫，只要在生物素存在期間發(fā)生，就會被“永久” biotin 標記下來。
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后續(xù)檢測：
- 用鏈霉親和素（Streptavidin）或 Avidin 進行 pull-down，把所有被生物素標記的蛋白拉下來。
- 通過質(zhì)譜（Mass Spectrometry） 鑒定這些蛋白，得到與 CASP5 鄰近的蛋白列表（圖1g 很可能就是這個結(jié)果，DVL1/2/3 高排名）。
- 圖1f 右側(cè)的免疫熒光圖像主要是展示融合蛋白在類器官中的表達和定位（綠色/藍色可能是 Phalloidin 標記肌動蛋白骨架 + DAPI 標記細胞核，紅色可能是 anti-MYC 標記融合蛋白）。
3. 圖1f 中的具體設(shè)計
- 左側(cè)示意圖：對比 CASP5A-BioID2（含 CARD 域）和 CASP5C-BioID2（缺 CARD 域），目的是比較不同亞型各自的鄰近蛋白網(wǎng)絡(luò)。
- 這是一種發(fā)現(xiàn)型（discovery）實驗：先用 BioID2 篩選出潛在互作伙伴（hit 如 DVL），再用 Co-IP、Western blot 等驗證型實驗確認（圖1i、j、k 等）。
優(yōu)點與局限（便于你理解實驗可靠性）
- 優(yōu)點：能在類器官這種接近生理的 3D 模型中進行，捕捉活細胞內(nèi)的動態(tài)互作。
- 局限：標記是不可逆的，可能會有假陽性（過于靠近但不直接互作的蛋白也會被標記），所以需要后續(xù)驗證。
簡單比喻：把 BioID2 想象成一個“帶標簽噴漆的小機器人”，它被綁在 CASP5 身上，只要周圍 10–20 nm 內(nèi)有蛋白路過，就給它噴上生物素漆。然后用磁鐵（鏈霉親和素）把所有噴了漆的蛋白吸出來分析。
