1. Single-cell and spatial transcriptomics of reovirus T1L-infected neonatal mice hearts

Fig 1A：為了探究reovirus誘導(dǎo)的心肌炎的病理生理過程，作者對新生鼠灌胃給了T1L呼腸孤病毒和mock control。取了感染后d1, d4, d7, d10的小鼠（和四個(gè)時(shí)間點(diǎn)對應(yīng)的mock，一共是8組）的心臟和回腸組織進(jìn)行了單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組測序。此外為了鑒定組織中reovirus的(非腺苷酸化)轉(zhuǎn)錄本，還在scRNA-seq library中做了一個(gè)病毒片段的hybridization-based enrichment。

Hybridization-based enrichment of viral fragments

這種比對病毒基因組的方法之前在新冠的文獻(xiàn)里見到過單細(xì)胞測序揭示COVID-19嚴(yán)重性與呼吸道上皮和免疫細(xì)胞的相互作用相關(guān)

Fig 1B C：心臟組織單細(xì)胞一共得到31684個(gè)細(xì)胞，分為18個(gè)細(xì)胞群?？辙D(zhuǎn)得到8243個(gè)spatial transcriptomes。
Fig 1D：回腸組織一共得到7,695單細(xì)胞和8,027spots。
Fig 1E：這個(gè)圖展示了檢測到病毒基因組的細(xì)胞的類型和比例。在回腸中，檢測到了13,100個(gè)病毒轉(zhuǎn)錄本，病毒載量在d1-d4逐漸降低。d1時(shí)，病毒感染的細(xì)胞主要是腸內(nèi)分泌細(xì)胞，其次是腸細(xì)胞和杯狀細(xì)胞。d4天時(shí)則變成了淋巴管細(xì)胞，提示病毒通過引流淋巴管進(jìn)入血液循環(huán)，并近一步進(jìn)入心臟。在心臟中，在392個(gè)細(xì)胞中共檢測出了2762個(gè)病毒的轉(zhuǎn)錄本。心臟中d4天時(shí)開始出現(xiàn)病毒感染的細(xì)胞，主要是心內(nèi)膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。d7時(shí)心臟中病毒陽性的細(xì)胞比例進(jìn)一步增加，主要仍然是心內(nèi)膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。病毒轉(zhuǎn)錄本數(shù)目在d10則出現(xiàn)下降，和體外病毒滴度測定相一致。在d7時(shí)，中性粒細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞中也檢測出了病毒，提示這些細(xì)胞可能作為病毒的carrier，促進(jìn)病毒擴(kuò)散。
Fig 1F：Cdh5和病毒轉(zhuǎn)錄本M3的共染提示受感染的內(nèi)皮與T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞存在共定位（？這不都是病毒陽性的嗎？T細(xì)胞在哪呢？）

Fig 1

Sup 1F 不同細(xì)胞在心臟的空間定位

2. Endothelial cells are primed with basal interferon response and play an important role in initiating host innate immune response

Fig 2A：為了探究感染后心臟組織中的早期轉(zhuǎn)錄差異，作者對d4心臟和mock心臟做了Differential Gene Expression Analysis (DGEA)。得到230個(gè)上調(diào)基因(logFC > 1.0, p-value < 0.01;??這個(gè)FC卡的這么高，得到的上調(diào)基因數(shù)，很少啊)，包括interferon-b pathway, interferon signaling和innate immune responses相關(guān)的基因。
Fig 2B：為了定量和比較不同細(xì)胞類型間的早期感染反應(yīng)嚴(yán)重程度，作者使用上面篩選出來的226個(gè)上調(diào)基因計(jì)算了心臟不同時(shí)間點(diǎn)不同細(xì)胞的infection response score, IR。結(jié)果顯示內(nèi)皮細(xì)胞在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)都有著最高的炎性反應(yīng)評分，和Mock相比，內(nèi)皮的感染反應(yīng)評分增長也是最高的。
這個(gè)結(jié)果提示內(nèi)皮細(xì)胞可能是機(jī)體抵御病毒感染的重要initiators。（不是很充分）
Fig 2C：空轉(zhuǎn)的數(shù)據(jù)提示d4 d7心臟的IR評分都出現(xiàn)增加，主要出現(xiàn)在myocarditic region。
Fig 2D：由于mock小鼠的內(nèi)皮細(xì)胞也有著最高的IR 評分，作者使用了Tabula Muris scRNA-seq mouse atlas的數(shù)據(jù)來查看這是否是在多種器官中存在的普遍現(xiàn)象。結(jié)果提示在多個(gè)器官中內(nèi)皮細(xì)胞都具有最高的IR評分。These results indicate that endothelial cells lining the vasculature have a higher basal expression of innate response genes within most tissues, which may prime these cells to respond to viral dissemination within the blood and lymphatics.
Fig 2E：隨后作者使用同樣的方法計(jì)算了回腸組織的差異基因，使用上調(diào)的基因計(jì)算了IR評分。在回腸組織不同細(xì)胞的IR評分中，腸細(xì)胞是最高的，其次是腸內(nèi)分泌細(xì)胞。
Fig 2F：空間組學(xué)的數(shù)據(jù)則提示回腸中最高的IR評分出現(xiàn)在腸粘膜和絨毛。

這種先找整體的高表達(dá)基因，再把高變表達(dá)基因當(dāng)成一個(gè)module，通過計(jì)算每個(gè)細(xì)胞類型的模塊評分來看哪個(gè)細(xì)胞類型反應(yīng)最大的思路很好啊，比之前讀的單細(xì)胞測序揭示心衰患者循環(huán)免疫細(xì)胞的廣泛變化里的Fig1 I那樣子先找差異基因然后在不同細(xì)胞里面畫基因的韋恩圖感覺更優(yōu)雅一點(diǎn)～

3. Cytotoxic T cells recruited by inflamed endothelial cells induce pyroptosis

Fig 3A B：為了進(jìn)一步探究心臟內(nèi)皮細(xì)胞的異質(zhì)性，作者對9,786個(gè)心臟內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行了重新聚類，得到四類細(xì)胞。
Fig 3C：亞群的差異基因分析提示D7 inflamed EC高表達(dá)趨化因子Cxcl9和Cxcl10。這兩個(gè)趨化因子在趨化T細(xì)胞反應(yīng)中起到重要作用。跟這個(gè)結(jié)果對應(yīng)的，7天的t細(xì)胞也高表達(dá)了Cxcl9和Cxcl10的受體Cxcr3。內(nèi)皮細(xì)胞還高表達(dá)粘附分子Vcam1和Icam1可能促進(jìn)免疫細(xì)胞的粘附。此外內(nèi)皮細(xì)胞還高表達(dá)MHC I類 (H2-D1，H2-K1) 和 MHC II類 (Cd74)分子，提示向T細(xì)胞的抗原呈遞增強(qiáng)。
Fig 3D：Cxcl9^high內(nèi)皮細(xì)胞的通路富集結(jié)果中也包含了白細(xì)胞粘連，T細(xì)胞活化，IL-8產(chǎn)生，細(xì)胞因子反應(yīng)，TNF活化，IFNG活化等通路（見sup）。這些通路的活化也主要存在于myocarditic region。

前面的結(jié)果提示內(nèi)皮細(xì)胞參與T細(xì)胞的活化和招募，因此作者下一步探究了T細(xì)胞的異質(zhì)性。
Fig 3E F：作者對心臟中浸潤的2205個(gè)T細(xì)胞進(jìn)行了重新聚類，得到了4個(gè)亞群。包括一個(gè)Tn群，一個(gè)Th群和兩個(gè)Tc群。
Fig 3G：差異分析結(jié)果提示Tc和Th細(xì)胞都高表達(dá)Cxcr3，還高表達(dá)Ifng, Ccl3, Ccl4, Ccl5, S100A4和S100A6，提示它們參與中性粒細(xì)胞招募和活化。Tc細(xì)胞在所有細(xì)胞中占比最高，還高表達(dá)Prf1, Gzma, Gzmb和Gzmk等顆粒酶依賴性胞吐作用相關(guān)的溶菌顆粒。
Fig 3H：通路富集結(jié)果中包含中性粒活化，抗原呈遞，NFkB，TNF活化等pathway。
此外，死亡相關(guān)pathway的下游分子如Pycard, Acer2, Zbp1, Casp1, Casp4和Casp12也在Cxcl9^high內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)，提示細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞可能是引起inflamed內(nèi)皮細(xì)胞死亡的原因。內(nèi)皮細(xì)胞的通路富集也富集到了死亡相關(guān)的pathway(Supp Fig. 3F)。在前面的結(jié)果中，心臟中T細(xì)胞也主要存在于myocarditic regions和border區(qū)。結(jié)合Fig 3D和H的結(jié)果，在Cxcl9^high內(nèi)皮細(xì)胞和Tc細(xì)胞中富集到的通路都主要存在于myocarditic regions，提示構(gòu)成心臟血管網(wǎng)絡(luò)的內(nèi)皮細(xì)胞在驅(qū)動(dòng)心臟適應(yīng)性免疫中起到重要作用。
結(jié)合前面的結(jié)果，在reovirus-induced myocarditis中，血管內(nèi)皮細(xì)胞受到了病毒的直接攻擊和趨化來的Tc細(xì)胞的攻擊。心臟中微血管網(wǎng)絡(luò)的損傷可能進(jìn)一步引起心臟血供受損，并且可能是進(jìn)一步免疫反應(yīng)介導(dǎo)的心肌細(xì)胞死亡的原因。

4. Spatially restricted gene expression in myocarditic tissue

心肌炎中心臟炎癥反應(yīng)的局灶性使得作者想要進(jìn)一步去探究reovirus感染心臟的空間基因表達(dá)異質(zhì)性。
Fig 4A：額 這個(gè)就是Fig 1C的那個(gè)圖摳出來的吧
Supp Fig. 4A：作者計(jì)算了myocarditic regions的上調(diào)基因，發(fā)現(xiàn)很多免疫細(xì)胞的marker(T細(xì)胞的makrer Cd8a和Gzma，NK細(xì)胞的Nkg7，中性粒細(xì)胞的S100a8)，inflammation的marker (Cd52和Lyc62)，趨化因子和細(xì)胞因子(Ccl5, Ccl2, Cxcl9和Cxcl10)的高表達(dá)。對應(yīng)的單細(xì)胞數(shù)據(jù)提示Ccl5主要是DC細(xì)胞表達(dá)，Ccl2主要是成纖維細(xì)胞表達(dá)，Cxcl9,10主要是內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)。
Supp Fig. 4B：Ccl2的受體Ccr2主要在巨噬細(xì)胞表達(dá)，和既往報(bào)導(dǎo)相一致，提示巨噬細(xì)胞主要由成纖維細(xì)胞趨化而來。
Supp Fig. 4C：border zones的上調(diào)基因。

Fig 4B：對myocarditic regions和border zones的空間差異基因中還存在其他有意思的基因，包括Timp1, AW112010, Clu, Ankrd1, Gm4841和Ctss。
Supp Fig. 4D：單細(xì)胞數(shù)據(jù)提示Timp1主要在inflamed fibroblasts中表達(dá)。Timp1是MMP(參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解)的天然抑制劑。后面幾個(gè)基因也是挨個(gè)解釋了一下意義以及跟心肌炎的聯(lián)系
Supp Fig. 4E：border zones上調(diào)基因的富集結(jié)果，富集到TNF, IL-1, NFkB等信號(hào)通路。

Fig 4C, Supp Fig. 1F：為了進(jìn)一步理解免疫細(xì)胞浸潤對myocarditic regions周圍細(xì)胞類型組成的影響，作者定量了不同細(xì)胞在myocarditic region, border區(qū)和其它心室組織中的比例變化，發(fā)現(xiàn)Cxcl9^high內(nèi)皮細(xì)胞，Ccl2⁺成纖維細(xì)胞，T細(xì)胞，DC和NK細(xì)胞在myocarditic regions增加，相應(yīng)的，心肌細(xì)胞比例下降。
Supp. Fig. 4G-4H：為了進(jìn)一步理解Ccl2⁺成纖維細(xì)胞，作者對成纖維細(xì)胞進(jìn)行了進(jìn)一步的聚類分群。得到了4個(gè)群。
Supp. Fig. 4I：Ccl2⁺成纖維細(xì)胞表達(dá)高水平的MHC I類分子(H2-D1 and H2-K1)，粘附分子Vcam1和Icam1，和其它基因比如Serpina3g, C3和Ms4a4d。此外這些成纖維細(xì)胞也高表達(dá)Casp1和Casp4，提示存在in response to cytotoxic T cells的焦亡反應(yīng)。

Fig. 4D-E：為了探究心臟炎癥浸潤對心肌細(xì)胞的影響，作者把心肌細(xì)胞也單獨(dú)提出來做了分群。得到了4個(gè)群。從右面的圖可以看到，d7 infected的心肌具有比較特殊的轉(zhuǎn)錄特征，d4 d10infected的心肌則和mock聚在一起。
Fig. 4F：為了探究border區(qū)心肌的轉(zhuǎn)錄特征，作者把心肌細(xì)胞marker和border區(qū)marker取了個(gè)交集，得到31個(gè)基因。
Supp Fig. 4F：31個(gè)基因中包括Gm4841, Gm12185, Mt1, Mt2, Ankrd1和Nppb。Gm4841和Gm12185是干擾素誘導(dǎo)基因，Mt1和Mt2在缺血性心肌病小鼠中可以調(diào)節(jié)炎癥，參與心肌重塑。Ankrd1是一個(gè)心肌存活因子，在晚期自發(fā)肥心的病人心臟中上調(diào)。

這些結(jié)果提示組織損傷主要存在于myocarditic regions，而border區(qū)則存在活躍的重塑，也提示著使用空間組學(xué)研究病毒性心肌炎的重要性。

Fig 4

Supp Fig. 4

5. Reduced adaptive immune cell infiltration associated with reovirus K287T mutant

最近報(bào)道了一種reovirus的變異株T1L S4-K287T (K287T)¹，這個(gè)變異株在編碼外衣殼蛋白sigma-3的S4基因上有一個(gè)點(diǎn)突變，這個(gè)蛋白是一個(gè)雙鏈RNA結(jié)合多功能蛋白，可以促進(jìn)病毒蛋白的合成，幫助病毒進(jìn)入細(xì)胞和組裝。K287T可以感染心臟但是和WT相比它產(chǎn)生的病毒滴度很低，并不引起心肌炎。
Fig. 5A, Supp Fig. 4J：為了驗(yàn)證前面的發(fā)現(xiàn)，作者額外對K287T細(xì)胞感染后d4, d7和d10的心臟進(jìn)行了單細(xì)胞測序。得到16771個(gè)細(xì)胞，隨后作者把這部分?jǐn)?shù)據(jù)和前面的數(shù)據(jù)做了整合。絕大多數(shù)K287T感染的細(xì)胞類型都可以和前面WT病毒感染的細(xì)胞類型聚在一起。
Supp Fig. 4K L：病毒轉(zhuǎn)錄本定量的結(jié)果提示，這種變異株病毒在d4的時(shí)候在心臟中的病毒載量和T1L差不多，但d7,d10時(shí)就顯著減少。
Fig. 5B：隨后作者比較了K287T和WT病毒感染后心肌細(xì)胞類型的早期宿主反應(yīng)。（跟Fig2一樣計(jì)算的d4的infection response score）結(jié)果提示不管是WT還是K287T病毒，內(nèi)皮細(xì)胞的感染反應(yīng)評分都是最高的。
Fig. 5C：作者比較了K287T和WT病毒感染后心臟中的細(xì)胞比例，結(jié)果提示K287T感染后d7的心臟中Cxcl9^high內(nèi)皮細(xì)胞和各種免疫細(xì)胞都出現(xiàn)下降。
這些結(jié)果提示盡管感染的是K287T病毒，心臟內(nèi)皮細(xì)胞仍然存在明顯的固有免疫活化，但是病毒復(fù)制在大多數(shù)細(xì)胞中都下降。d7之后，隨著病毒逐漸在細(xì)胞中被清除和較弱的適應(yīng)性免疫應(yīng)答的活化，K287T感染的心臟出現(xiàn)了非心肌炎表型。

整體上得到的病理生理機(jī)制是：
呼腸孤病毒在進(jìn)入腸道1d之后，感染腸道上皮的內(nèi)分泌細(xì)胞和腸細(xì)胞，這些細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的固有免疫反應(yīng)以抑制病毒復(fù)制。病毒隨后感染腸道淋巴管細(xì)胞(d4)，并通過腸道引流淋巴管進(jìn)入血液，隨后定植在心臟。心臟內(nèi)皮細(xì)胞是最早對病毒起反應(yīng)的細(xì)胞(d4)，出現(xiàn)了明顯的固有免疫反應(yīng)的活化。inflamed EC釋放趨化因子Cxcl9和Cxcl10，趨化Tc細(xì)胞，并通過上調(diào)MHC I類和II類分析增強(qiáng)向T細(xì)胞的抗原呈遞。趨化而來的Tc細(xì)胞可以誘導(dǎo)心肌組織焦亡。

分析主要是用Scanpy做的，整合單細(xì)胞和空轉(zhuǎn)數(shù)據(jù)用的scvi-tools包的Stereoscope反卷積算法。做通路富集用的是gseapy，python版的gsea。

這篇文章，測了這么多數(shù)據(jù)，這么分析感覺有點(diǎn)浪費(fèi)。但是不管分析的怎么樣，單細(xì)胞+空間轉(zhuǎn)錄組的優(yōu)勢還是非常明顯的。

參考文獻(xiàn)：
1: The multi-functional reovirus 3 protein is a virulence factor that suppresses stress granule formation and is associated with myocardial injury. PLOS Pathog. 17, e1009494 (2021).