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//文獻
2021年發(fā)表于Cancer Discovery，影響因子39.397，典型的幾乎純分析的單細胞轉錄組文章。
Resolving the spatial and cellular architecture of lung adenocarcinoma by multi-region single-cell sequencing
//摘要
文章對來自5 個早期 LUAD 和 14 個多區(qū)域距離腫瘤很近的正常肺組織的186,916 個細胞進行單細胞 RNA 測序。展示了從正常區(qū)域向LUAD轉變的細胞譜系、狀態(tài)和轉錄特征。LUAD表現(xiàn)出明顯的腫瘤內(nèi)單個位點的細胞異質性和轉錄譜系可塑性。T regulatory cell在與LUAD 接近的正常組織中的細胞中增加，細胞毒性 CD8+ T 細胞、抗原呈遞巨噬細胞、炎性樹突狀細胞減少。進一步發(fā)現(xiàn) LUAD 配體-受體相互作用中具有介導促腫瘤表型的上皮CD24表達增加。這些數(shù)據(jù)提供了 LUAD 演化的空間圖譜，以及用于識別治療目標的數(shù)據(jù)資源。
//實驗設計
文章在單細胞分辨率上辨別周圍肺和早期 LUAD 的空間圖譜，以更好地理解 LUAD 演化的結構。我們對 19 個空間區(qū)域進行了深度 scRNA-seq 分析，包括富集的上皮細胞群，來自 5 個早期 LUAD 和 14 個多區(qū)域距離腫瘤很近的正常肺組織。 文章致力于揭開LUAD腫瘤進化軌跡，細胞群的空間進化，以及描述早期 LUAD 的表達特征。
5例早期LUAD，P2-P5分別取腫瘤、癌旁、中間、遠端組織，P1無中間樣本。
//分析思路
思路總結：
1.基因集評分在單細胞中的廣泛應用，很多文章都有自定義的基因集。
2.本篇文章巧妙的實驗設計，為早期LUAD多區(qū)域圖譜增加了很多內(nèi)容。
3.如何從分析結果中找到有意思的分析點？并通過多種方法論證推斷。
//主要結果
- 問題：早期LUAD的單細胞圖譜是怎樣的？
P1樣本單獨進行scRNA分析，共得到15132個細胞，EPCAM+上皮細胞在三個不同位置的平均比例為4.2%。為了更好的描繪上皮細胞譜系，對P2-5樣本進行流式分選，分為EPCAM+和EPCAM-，以富集上皮細胞，共得到186916個細胞，中值基因1844，上皮細胞比例37.6%。
相比于正常組織，增殖上皮細胞主要在LUAD中富集，而且EPCAM+細胞基因表達數(shù)目高于EPCAM-。層次聚類結果表明LUAD中細胞類型和正常組織轉錄差異明顯。對空間細胞組成的分析顯示，腫瘤鄰近程度越高，其拓撲梯度越明顯，這在所有患者中都是一致的，特別是在LUAD中，B細胞的比例增加，NK細胞的比例下降。
這些結果表明了早期LUAD在腫瘤微環(huán)境(TME)中的空間轉錄組異質性。
- 問題：肺上皮細胞的空間差異和LUAD的腫瘤內(nèi)異質性如何？
上皮細胞進一步細分為10個細胞類型。C9主要來自LUAD樣本，且CNVscore非常高。相對于來自腫瘤中間或遠處正常位點的細胞，來自癌旁正常組織的細胞在轉錄規(guī)律上與LUAD的細胞更相似。
肺泡分化層次已被證明參與肺腫瘤的體內(nèi)發(fā)展。在我們的隊列中，具有明確譜系特征的肺泡細胞(如AT1、AT2和肺泡祖細胞)在LUAD組織中消耗殆盡。通過擬時序分析發(fā)現(xiàn)了AT2向AT1分化的軌跡，而且NOTCH信號也在分化軌跡中逐漸增高。
C9進一步細分，發(fā)現(xiàn)P2中的LUAD CNV score較低，因此對KRAS進行突變檢測(5` scRNA，可以檢測到)，P2中29%的C9細胞攜帶KRAS G12D突變，和KRAS野生型細胞相比，高表達MUC5AC和LCN2等基因。這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了KRAS驅動突變和細胞譜系的空間異質性模式，這可能是KRAS突變LUAD生態(tài)特有的。
和P2不同，P3中C9存在大規(guī)模的染色體變異，主要分為4個cluster，C2-4變異較為明顯，且C4存在一處特異的CNV事件，可能處于P3 LUAD演化軌跡的后期，軌跡分析也證明了這一點。P5中C9分為7個不同的cluster，擬時序分析顯示C4到C1的分化軌跡。
- 問題：淋巴細胞重編程如何促進腫瘤微環(huán)境？
淋巴細胞進一步細分，共發(fā)現(xiàn)10個細胞類型，相對于正常組織，LUAD富含plasma(SDC1+/MZB1+)、B (CD19+/CD22+)和T regulatory(Treg;FOXP3 +)細胞。隨著腫瘤鄰近程度的增加，我們注意到NK(GNLY+)和 innate lymphoid cells(ILCs)， GZMA-hi和GNLY-hi的CD4+ cytotoxic T(CTL;CD40LG +,BATF+)和GNLY-hi CD8+ CTL逐漸降低，在LUAD中都被耗盡。
通過基因集評分，Naive CD8表現(xiàn)出高初始、低毒性特點。GNLY-hi CD8+ CTL高表達細胞毒性基因，但是在LUAD樣本中耗盡。CD8+ CTL顯示空間調(diào)節(jié)顯著降低細胞毒性標記評分，并降低主要細胞毒性基因如NKG7和GNLY的表達，LUAD中這些基因表達都是最低的。
LUAD組織特異性富集FOXP3+ Tregs，Treg score隨著LUAD的距離而顯著增加。Tregs細胞也表達高水平的腫瘤免疫檢查點。共表達CTLA-4和TIGIT免疫檢查點的Tregs的比例沿著遠端正常位點到更接近腫瘤區(qū)域逐漸升高，Treg score隨著LUAD的臨近而顯著增加。
分析plasma和B細胞發(fā)現(xiàn)，吸煙者(P2和P3)的plasma比例明顯高于非吸煙者，TCGA的數(shù)據(jù)也證明了這一點。我們還鑒定了3種不同的B細胞亞群，包括一個LUAD富集的亞群(C0)，其高表達RAC2+和ACTG+，已知在B細胞突觸形成中起關鍵作用。與匹配的正常肺組織相比，B細胞signature(C0)在非典型腺瘤性增生(AAH)、LUAD的腫瘤前前體和侵襲性LUAD中逐漸增加，B細胞signature也與延長的總生存期(OS)和無進展間期(PFI)相關。
- 問題：LUAD早期抗原提呈髓細胞的特點？
髓系細胞進一步細分，發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤鄰近程度的增加，M2-like macrophages C5、monocytes經(jīng)典和非經(jīng)典)和mast逐漸減少，而M2-like macrophages C1、 proliferating myeloid和cDC2細胞在腫瘤中穩(wěn)步富集。此外，我們發(fā)現(xiàn)，與主要富集在正常樣本中的C5 M2-like macrophages相比，C1 M2-like macrophages的抗原呈遞評分顯著降低，隨著LUAD的空間鄰近性增加，抗原提呈標記基因的表達水平顯著降低。
三個cDC2亞群中，C1炎癥基因score最低，并在LUAD中大量富集。炎癥信號(高度富集于C2)和MHC II類基因(富集于C0/C1)的差異表達，此前已被證明可以區(qū)分炎癥性和非炎癥性cDCs。炎癥評分最高的cDC2亞群(C2)進一步以空間上的炎癥標志物評分為特征，隨著腫瘤鄰近程度的增加而顯著減弱。非炎癥性與炎癥性的得分在cDC2中相對較高在TCGA LUAD隊列中與OS和PFI延長相關。
- 早期LUAD的受配體互作特性
利用iTALK內(nèi)置數(shù)據(jù)庫針對 checkpoint-receptor、cytokine-receptor進行計算分析和標注。計算Jaccard index，發(fā)現(xiàn)與更近端(相鄰，中間)區(qū)域相比，腫瘤與遠處正常組織之間的L-R相互作用重疊減少。我們發(fā)現(xiàn)，與它們各自的空間正常組織相比，LUADs中改變的細胞相互作用受到顯著和差異的調(diào)節(jié)。在細胞因子受體對中，LUADs顯示CX3CL1+腫瘤上皮細胞與表達其同源受體CX3CR1的DCs或巨噬細胞之間的交流增加。
值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)腫瘤上皮細胞上的免疫檢查點蛋白CD24或LGALS9 和巨噬細胞上的SIGLEC10或DC上HAVCR2之間的相互作用增強，并且在多個患者中共享。這些相互作用在與LUAD距離不同的腫瘤組織與正常組織中差異富集。CD24和LGALS9在LUAD組織的上皮細胞中表達水平總體上增加，特別是在惡性腫瘤富集的細胞簇中。這些發(fā)現(xiàn)表明，早期LUAD生態(tài)中存在細胞互作，使促腫瘤炎癥和免疫抑制狀態(tài)增加。
上述發(fā)現(xiàn)促使我們使用外部隊列來驗證CD24表達模式。我們發(fā)現(xiàn)該抗原在正常肺組織、AAHs和LUADs中的表達逐漸顯著增加。CD24與上皮marker EPCAM的表達以及促腫瘤和免疫抑制基因(TIGIT, CTLA4, FOXP3, CCL19)的水平呈正相關，而與抗腫瘤免疫標記物(GZMB, GZMH, PRF1)負相關。使用早期LUAD內(nèi)部隊列，我們發(fā)現(xiàn)相對較高的CD24與縮短的OS和PFI相關。我們進一步發(fā)現(xiàn)，在同基因小鼠模型中，通過CRISPR介導敲除Cd24a或使用中和抗體抑制Cd24a，顯著降低了小鼠LUAD細胞在體內(nèi)的生長。這些發(fā)現(xiàn)表明，在早期LUAD中，CD24是一個富集的細胞互作的核心，它與促腫瘤免疫環(huán)境和不良預后相關，并促進LUAD在體內(nèi)的生長，相對較高的CD24與縮短的OS和PFI相關
