背景介紹
紅大戟（Knoxia valerianoides）為茜草科植物，是我國重要的中藥材。具有清熱解毒、抗炎、抗腫瘤等藥理作用，在臨床上廣泛用于治療炎癥、癌癥及感染性疾病。其根部的活性成分以蒽醌類和三萜類化合物為主，具有重要藥用價值。近年來，隨著市場需求增加，紅大戟的大規(guī)模種植不斷擴展，但現(xiàn)象普遍存在，導致土壤理化性質退化、微生物群落失衡，進而引起產量下降、品質降低，根腐病等土傳病害高發(fā)，已成為制約其人工種植可持續(xù)發(fā)展的關鍵因素。
連作障礙是指同一地塊連續(xù)多年種植同種作物后，植株生長減弱、病蟲害加重、產量品質下降的現(xiàn)象。其主要成因包括：土壤理化性質惡化（pH變化、養(yǎng)分失衡）、自毒物質積累（酚酸類等化感物質）、根際微生物群落失衡（有益微生物減少、病原微生物富集）。在丹參、三七、黃連等藥用植物中均有報道，連作會導致土壤微生物區(qū)系從健康向病害轉變，進而誘發(fā)根腐病等土傳病害。
近年來，高通量測序技術（如Illumina MiSeq）為解析微生物群落提供了有力工具，具有通量高、無需培養(yǎng)、覆蓋全面等優(yōu)勢，已廣泛應用于土壤、根際及植物內生真菌的研究。根際與內生真菌在植物營養(yǎng)吸收、病原抑制及免疫調節(jié)中發(fā)揮重要作用，其群落失衡被認為是根腐病發(fā)生的重要原因。
目前，紅大戟根際與內生真菌在連作條件下的變化機制還缺乏研究。本研究采用高通量測序技術，系統(tǒng)對比不同連作年限及根腐病狀態(tài)下，根際與根部內生真菌的多樣性、群落結構及其與土壤理化性質的關系，為闡明根腐病發(fā)病機制及連作障礙治理提供科學依據(jù)。
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研究進展（研究現(xiàn)狀）
1、“Tan Y et al., 2017”采用Illumina MiSeq高通量測序技術，對連作條件下三七的根際與根部內生真菌群落進行了系統(tǒng)研究。結果表明，連作導致根際土壤與根部內生真菌多樣性升高，子囊菌門、接合菌門、擔子菌門和壺菌門為主要優(yōu)勢菌門。根腐病感病植株根際與根部的真菌多樣性低于同一年份健康植株，表明根腐病對真菌群落結構與多樣性產生顯著影響。
2、“Alami MM et al., 2020”通過高通量測序技術研究了連作對黃連根際土壤真菌群落結構、功能、多樣性和組成的影響。研究檢測到子囊菌門、擔子菌門、壺菌門、球囊菌門和被孢霉門五大真菌門類，其中子囊菌門為優(yōu)勢菌門。分析顯示連作5年的黃連田中真菌多樣性高于荒田。同時揭示了土壤理化性質與真菌群落結構之間的關系，為緩解黃連連作障礙提供了重要參考。
3、“Bao L et al., 2022”基于UPLC-MS/MS和Illumina MiSeq高通量測序技術，探究了三七連作根際土壤中酚酸類自毒物質與微生物之間的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，連作顯著改變了微生物群落結構，增加了細菌多樣性但降低了真菌多樣性。外源酚酸（p-HA和VA）可促進病原菌（包括鐮刀菌屬和Ilyonectria）的生長，是連作條件下三七的主要酚酸類自毒物質。土壤速效鉀、全氮、有機質和水解性氮與土壤微生物群落的關聯(lián)最為顯著。該研究表明酚酸與根際微生物的互作是干擾三七根際微生態(tài)的主要原因。
4、“Li M et al., 2020”該研究比較分析了不同產量三七的根際微生物群落組成與功能。研究發(fā)現(xiàn)根際微生物群落結構與三七產量密切相關，連作導致根際有益微生物減少、病原菌累積是三七產量下降的重要驅動因素。根際微生物群落的失衡是導致不同地塊產量差異的重要原因。
論文核心信息
論文標題：Assessing the biodiversity of rhizosphere?and endophytic fungi in Knoxia valerianoides?under continuous cropping conditions（連作條件下紅大戟根際與內生真菌的生物多樣性評估）
作者：Chunju Liu, Lei Zhang, Heng Li, Xiahong He, Jiahong Dong, Bin Qiu
作者第一單位：云南農業(yè)大學植物保護學院
根際真菌和內生真菌在植物健康和作物生產力中起著重要作用。然而，其在連作過程中的群落動態(tài)卻鮮有報道。紅大戟是茜草科的多年生草本植物，長期以來一直被用作草藥。本研究使用高通量測序技術Illumina MiSeq來研究紅大戟根際和內生真菌的結構和功能動態(tài)。結果表明，連續(xù)種植增加了根際真菌的豐富度和多樣性，但同時導致根際真菌的豐富度和多樣性下降。根部內生真菌群落多樣性低于根際真菌。在連作過程中，子囊菌門和擔子菌門是優(yōu)勢菌門。此外，我們還發(fā)現(xiàn)根腐病直接影響根際和根部真菌群落的結構和多樣性。因此，根腐病植株的根際和內生真菌群落都比健康植株表現(xiàn)出更高的豐富度。2年生和3年生根腐病植株中鐮刀菌的相對豐度顯著高于對照，表明連續(xù)種植對紅大戟的健康產生了負面影響。分析表明，土壤pH、有機質(OM)、速效鉀、全鉀、土壤蔗糖酶(S_SC)、土壤過氧化氫酶(S_CAT)、土壤纖維素酶(S_CL)與真菌群落動態(tài)變化顯著相關(p<0.05)。本研究首次報道了紅大戟根際和根部真菌種類的多樣性。根際土壤真菌多樣性高于根際內生真菌。根腐病植株的真菌多樣性高于健康植株。土壤pH、有機質、速效鉀、全鉀、S_CAT、S_SC和S_CL與真菌多樣性顯著相關。根腐病的發(fā)生對根際和根際內生真菌的群落結構和多樣性產生了影響。
關鍵詞：紅大戟、連作、根際真菌、內生真菌、理化性質
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發(fā)表雜志：BMC Microbiology
主要科學問題：
1、不同連作年限下，紅大戟根際與內生真菌的多樣性和群落結構如何變化？
2、根腐病對紅大戟真菌群落組成有何影響？
3、土壤理化性質與酶活性如何調控真菌群落動態(tài)？
研究方法
采樣設計：于云南省大理白族自治州祥云縣紅大戟主產區(qū)，共選取6塊樣地進行采集，每個樣地中5個植株的根系土壤樣品合為一個樣品，并采集未種植區(qū)域作為對照。采集1-3年生健康植株和根際土壤、2-3年生根腐病植株和根際土壤，采樣深度為0-30cm。
樣品處理：根部樣品經(jīng)流水沖洗、無菌水清洗、70%乙浸泡4min、2%次氯酸鈉洗滌1-2min，后備用；土壤樣品過4mm篩去除雜質，與根部樣品一同置于-80℃保存。
測序與分析：采用PowerSoil Pro DNA試劑盒提取微生物基因組DNA，以ITS基因作為靶點進行PCR擴增，通過 Illumina MiSeq PE300平臺測序；原始數(shù)據(jù)經(jīng)質控、OTU 聚類（97%相似度）后，進行Alpha多樣性、NMDS、CCA 等統(tǒng)計分析。
土壤指標測定：采用玻璃電極測定pH，重鉻酸鉀氧化滴定法測定有機質（OM），鉬藍法測定速效磷（AP），并通過試劑盒檢測土壤過氧化氫酶(S_CAT)、土壤尿素酶(S_UE)、土壤蔗糖酶(S_SC)和土壤纖維素酶(S_CL)酶活性。
創(chuàng)新點
首次系統(tǒng)揭示紅大戟根際與內生真菌的多樣性特征，明確根際真菌多樣性顯著高于根部內生真菌，填補該物種根部微生物復合體研究空白。
區(qū)分健康植物與根腐病植株雙重因素，揭示根腐病對紅大戟根際和根部內生真菌群落的影響。
將真菌群落動態(tài)與土壤理化性質（pH、有機質、養(yǎng)分）及酶活性（CAT、SC、UE、CL）多因子進行關聯(lián)，明確了驅動真菌群落變化的關鍵環(huán)境因子。
主要結論
1. 土壤理化性質與酶活性的變化
連作顯著改變了土壤性質。與未種植對照（S_CK）相比，連作土壤的pH、有機質、水解性氮、有效磷、全氮、全磷及蔗糖酶、脲酶活性均顯著升高（p<0.05）。感病植株土壤的pH和過氧化氫酶活性高于健康植株，而速效鉀和脲酶活性則較低（表1）。
2. 真菌群落的整體組成與α多樣性：共獲得3211327條高質量ITS序列，聚類為5312個OTUs。稀釋曲線趨于平緩，覆蓋度均高于99.31%，表明測序數(shù)據(jù)充分。
根際真菌的豐富度（Sobs、Chao、Ace）和多樣性（Shannon）顯著高于根部內生真菌。
隨著連作年限增加，健康植株根部內生真菌的豐富度（Ace、Chao）逐漸下降；而根際真菌的豐富度反而上升。
根腐病感病植株的根際和根部內生真菌多樣性均高于健康植株（R_D3 > R_H3，S_D3 > S_H3）。田間調查顯示，根腐病發(fā)病率隨連作年限增加而上升，與真菌多樣性變化趨勢一致。
3. 真菌群落結構：根際土壤和根樣真菌群落結構共有16門、61綱、152目、365科、883屬。
門水平：子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）為優(yōu)勢菌門。在R_H3和R_D3中，子囊菌門相對豐度分別高達90.86%和98.88%。
屬水平：土壤和根樣中部分真菌屬的相對豐度在不同連作年限之間存在顯著差異。對照土壤（S_CK）中優(yōu)勢屬為 Solicoecozyma（8%），但其豐度隨連作年限的升高而降低。健康3年根際土（S_H3）中 Mortierella（被孢霉屬）和 Didymellaceae 為優(yōu)勢菌；感病土壤（S_D3）中兩者豐度更高。
Fusarium（鐮刀菌屬）和 Gibberella 的豐度隨連作年限及根腐病發(fā)生而顯著增加。
根部內生真菌中，R_H3以 Phialophora（64%）為主，R_D3中 Phialophora 仍占41%；R_D2中 Exophiala 占28%。結果表明（圖3B），不同樣品間真菌群落組成差異顯著(R=0.7925，p=0.001)，表明連作對真菌群落有顯著影響。
對豐度前 35 的真菌屬做層級聚類分析（圖3A），連作年限顯著改變土壤、根系各真菌屬相對豐度。S_CK 以Solicoccozyma為主且隨連作年限豐度下降；Mortierella、Didymellaceae、Chaetomiaceae、Olpidium、Phialophora、Exophiala、Issatchenkia 分別為不同連作處理土壤/根系的優(yōu)勢屬，且同類群在不同年限樣本間豐度有明顯差異。
基于 abund-jaccard 距離開展NMDS分析（圖3B），組間群落差異顯著（R=0.7925，p=0.001），說明連作顯著影響珠子參根際及根系真菌群落組成與結構。
4. 環(huán)境因子與真菌群落的相關性
研究發(fā)現(xiàn)，pH、全磷、全鉀、全氮與纖維素酶活性（S_CL）之間存在相互關聯(lián)；有機質、水解性氮、速效鉀、脲酶活性（S_UE）與纖維素酶活性（S_CL）同樣存在組內相關性。此外，pH、有機質（OM）、速效鉀、全鉀、全磷、過氧化氫酶活性（S_CAT）、蔗糖酶活性（S_SC）、纖維素酶活性（S_CL） 均與真菌群落結構呈顯著相關（圖 4A）。
Spearman熱圖（圖4B）顯示，油壺菌屬（Olpidium） 相對豐度與脲酶活性、纖維素酶活性、速效鉀、有機質、水解性氮呈顯著負相關，與全鉀、pH、過氧化氫酶活性呈顯著正相關；指梭孢屬（Dactylonectria） 相對豐度與全鉀、pH、過氧化氫酶活性呈顯著正相關；瓶霉屬（Phialophora） 相對豐度與有機質、水解性氮、蔗糖酶活性呈顯著正相關（圖 4B）。
個人評述
本論文采用高通量測序技術，系統(tǒng)對比了不同連作年限的紅大戟健康植株及根腐病感病植株其根際與內生真菌群落的差異。研究發(fā)現(xiàn)，連作會導致紅大戟根際真菌豐富度增加，但根部內生真菌豐富度下降。根腐病感病植株的真菌多樣性反而高于健康植株，這可能與病原菌入侵后條件致病菌或腐生菌的增殖有關。鐮刀菌屬的顯著富集進一步證實了其為根腐病的重要病原菌。同時也指出土壤pH、有機質及多種酶活性是真菌群落變化的關鍵驅動因子。
通過學習本研究的思路與方法，對植物-微生物互作領域的研究設計有了更深入的理解。其創(chuàng)新之處在于同時考慮了連作年限和病害狀態(tài)兩種影響因子，并且將根際真菌與根際內生菌分開分析，精確的揭示了微生物群落在不同生境中的差異。此外，該研究通過CCA和相關性等分析，將真菌群落結構與土壤理化、酶活性數(shù)據(jù)關聯(lián)分析，有助于進一步闡明連作條件下土壤微環(huán)境與微生物群落的互作規(guī)律，為探究紅大戟連作障礙成因提供依據(jù)。該技術路線同樣適用于其他藥用植物的連作障礙研究，通過不同因素之間的對比分析，明確植物與土壤環(huán)境之間的關系，為緩解藥用植物的連作障礙及合理種植提供理論參考。
