今年1月份發(fā)表在Cell Death Dis (IF: 9.685)上的文章

1. Danger signal extracellular calcium and CPPs induce differentiation of monocytes into macrophage-like cells

作者此前的研究顯示在LPS存在的情況下，胞外鈣濃度的增加可以作為danger signal激活NLRP3炎癥小體和細胞焦亡。Here we show that the danger signal extracellular calcium induces macrophage differentiation and survival when LPS is absent.
Fig 1a-c：在胞外鈣濃度增加的情況下，單核細胞分化成macrophage樣細胞 (calcium-macrophages)。當不存在其他survival factors，只有FCS- supplemented culture media時，培養(yǎng)的細胞會在2天左右死亡。與“煎蛋狀”的GM-CSF-macrophages和M-CSF-macrophages相比，calcium-macrophages呈“needle-like shape”。
Fig 1d：和M-CSF-macrophages的多核相比，calcium-macrophages與GM-CSF-macrophages一樣，主要是單個核。
Fig 1e：沒有calcium or growth factors的單核細胞在兩天內(nèi)死亡。在鈣誘導單核細胞分化的第二天，活細胞比例為57.0% ± 5.3（GM-CSF-macrophage cultures: 97.0% ± 0.8； M- CSF-macrophage cultures: 96.0% ± 0.3）。在第七天時，所有的培養(yǎng)方式都有大于97%的巨噬細胞存活率。

Fig 1f：為了探究CaSR在calcium- macrophages分化中的作用，作者使用了CRISPR-Cas9構(gòu)建的CaSR-deficient monocytic THP-1細胞系。結(jié)果顯示CaSR-deficient monocytic THP-1細胞對胞外鈣信號增加的敏感性下降，細胞分化減少。

在此前的研究中，作者發(fā)現(xiàn)RA患者的單核細胞表達CaSR增加。
Fig 1g：Accordingly, 和正常相比，RA患者的單核細胞分化成的calcium-macrophages， elongation factor更高。

此前的研究顯示，胞外鈣離子的增加引起CPPs (composed of calcium, phosphate, and fetuin-A) 的合成增加，CPPs可以通過calcium-induced macropinocytosis被單核細胞攝取。為了探究CPPs對calcium-macrophages分化的影響，CPPs也被用于誘導巨噬細胞分化。
Fig 1h：CPPs induce the differentiation of calcium- macrophages when the uptake of CPPs by macropinocytosis was facilitated by the presence of calcium.

2. Calcium-macrophages are different from GM-CSF- macrophages and M-CSF-macrophages

為了探究calcium-macrophages 和 GM-CSF 以及M-CSF-macrophages相比的異質(zhì)性，作者對這三種細胞進行了CITE-seq測序。
Fig 2a-b：一共得到了16470個巨噬細胞(4362 calcium-macrophages, 6588 GM-CSF-macro- phages, 5520 M-CSF-macrophages)，分為11個細胞群。結(jié)合蛋白標簽，可知clusters 2, 5, 和 11 是calcium macrophages；clusters 1, 4, 和 9 是 GM-CSF- macrophages；clusters 3, 6 和7 是 M-CSF- macrophages. Clusters 8 和 10 并沒有 mapped 到上述三類細胞。而且UMAP降維結(jié)果顯示，calcium- macrophages和另外兩種細胞存在較大轉(zhuǎn)錄差異。
Fig 2c-f：展示了每群的marker基因。calcium macrophages高表達SPP1。而且f圖的結(jié)果顯示，calcium macrophages和其他兩類巨噬細胞存在完全不同的表達模式。

calcium macrophages的TREM2也是高的啊，感覺比SPP1更特異。

為了進一步探究calcium macrophages分化過程中的基因表達模式，作者進行了DNA microarray analysis (n = 4)。
Fig 2g-h：結(jié)果顯示：最顯著的基因表達變化發(fā)生在分化起始的前兩天。pca的結(jié)果也顯示在day-1和其他的差異最大，day-2 到 day-7的轉(zhuǎn)錄模式則更為類似。

Fig 2

因為作者測的是CITE-seq，前面分析了單細胞的轉(zhuǎn)錄差異之后，作者又分析了蛋白差異。
Fig 3a：同樣的，calcium macrophages和其他兩組存在明顯蛋白表達差異。
Fig 3b-e：分別是GM的上調(diào)基因、M的上調(diào)基因、Ca和GM相比的上調(diào)基因及Ca和M相比的上調(diào)基因。
Fig 3f-h：calcium macrophages顯著上調(diào)的蛋白包括FABP4, FABP5和SPP1。
Fig 3i：Resting calcium-macrophages 可以分泌高濃度 SPP1/ Osteopontin, 而RA patients的 calcium-macrophages 產(chǎn)生了更高濃度的 SPP1/Osteopontin。

SPP1/Osteopontin can be modified by thrombin cleavage which exposes an epitope for integrin receptors
Fig 3j：F2/ prothrombin也是上調(diào)的top30蛋白之一(e)，在calcium-macrophages中顯著上調(diào)。
Fig 3k：一致的，cleaved SPP1/Osteopontin在calcium-macrophages的培養(yǎng)上清中被檢測到，而且在RA calcium-macrophages的上清中濃度更高。
Fig 3l：此外，CD44 (SPP1/Osteopontin的受體)也顯著上調(diào)(e)，在calcium-macrophages中顯著上調(diào)。

Fig 3

3. Calcium-macrophages have a pro-inflammatory and migratory phenotype

為了探究calcium-macrophages 在激活后更像GM- CSF-macrophages 還是 M-CSF-macrophages，作者使用LPS誘導巨噬細胞活化。
Fig 4a-d：LPS促進了多種促炎性細胞因子的表達。

隨后作者對LPS-stimulated macrophages進行了蛋白質(zhì)組學分析。結(jié)果顯示LPS-activated calcium-macrophages和另外兩種巨噬激活后存在顯著差異，更高的表達各種促炎因子和趨化因子比如IL1A和IL1B。

We have previously shown that LPS together with the danger signal extracellular calcium activates the NLRP3 inflammasome, which leads to the secretion of IL-1β and IL-18.
Fig 5a-e：和control相比，激活的calcium-macrophages產(chǎn)生更高的促炎因子IL-1β, IL-1α, 和 IL-18。而抑炎的IL-1RA 和 IL-18bp 則產(chǎn)生較低。RA calcium-macrophages responded with an even higher pro- inflammatory and a lower anti-inflammatory cytokine production compared to healthy donors
Fig 5f-g：Both anti-inflammatory cytokines were also secreted by resting calcium-macrophages.
Fig 5h-i：和control相比，calcium-macrophages 還產(chǎn)生更高水平的PGE2和COX2。
Fig 5j-m：劃痕實驗顯示RA calcium-macrophages的遷移潛能更高。

4. Calciprotein particles are not degraded in the lysosomes

單核細胞攝取 CPPs 是通過 calcium-induced, CaSR-依賴性 macropinocytosis (巨胞飲)。而CaSR-deficient THP-1由于不能感受鈣離子因而不能發(fā)生macropinocytose CPPs。
Fig 6a：PMA是macropinocytosis的誘導劑，PMA誘導下，CaSR-deficient THP-1通過macropinocytosis 對 CPPs 進行吞噬時，elongated calcium-macrophages被檢測到 (和沒有PMA相比)。
Fig 6b-d：Macropinosomes fuse with lysosomes to initiate degradation of macropinosome content. 作者使用 lysotracker 對lysosomes進行染色，calcein-labeled CPPs和lysosomes的共定位僅在一小部分CPP陽性的單核細胞中檢測到。

為了分析單核細胞溶酶體中蛋白的降解，作者使用了DQ-BSA。

DQ-BSA染料：一種被熒光染料標記的自淬的蛋白質(zhì)，一旦進入溶酶體，DQ-BSA就會被溶酶體蛋白酶裂解，導致熒光片段的不淬滅和釋放，發(fā)出明亮的熒光。因此，DQ-BSA可用來指示溶酶體的功能是否正常。

Fig 6e-g：結(jié)果顯示僅有一小部分的CPP⁺單核出現(xiàn)了DQ-BSA的陽性，而CPP^-單核則有很多出現(xiàn)了DQ-BSA的陽性。calcein-labeled CPPs 和 DQ-BSA共定位分析顯示most of the DQ-BSA was found not to be co-localized with CPPs。

最近有研究顯示CPPs可以增加 the fused endosomes/lysosomes 的PH，因此 pH-sensitive dyes 比如 lysotracker 不適合于這種情況下的lysosomes檢測。
Fig 6h-j： indeed, lysotracker fluorescence was reduced
Fig 6k-m： 而pH-依賴性 LAMP2 溶酶體染色在calcium-stimulated monocytes增加，提示鈣離子引起 fused endosomes/ lysosomes的PH增加和lysosome content增加。

為了分析calcium-macrophages的溶酶體PH，作者使用了LysoSensor dye.
Fig 6n-o： 和預期一致，calcium-macrophages的平均熒光強度下降。

當 CPP 存在時，DQ-BSA 不降解，并且calcium- stimulated monocytes的fused endosomes/lysosomes 中 pH 值升高表明 CPP 和所含的胎球蛋白 A 無法降解，這可以引起溶酶體應激。 如果在巨胞飲作用后胎球蛋白-A 確實沒有被降解，它應該仍然存在于分化的巨噬細胞中 7 天。
Fig 6p： 果然，calcium-macrophages的bovine fetuin-A比對照要高。

5. Disruption of lysosomal homeostasis induces TFEB and STAT3 transcription factors

眾所周知，溶酶體穩(wěn)態(tài)與雷帕霉素機制靶點（mTOR）途徑相關(guān)，當溶酶體功能正常時，轉(zhuǎn)錄因子EB（TFEB）以mTORC1依賴性方式磷酸化并保留在細胞質(zhì)中。 當溶酶體功能受損時，mTORC1 失活，未磷酸化的 TFEB 易位進入細胞核并啟動溶酶體蛋白的表達。
Fig 7a： 作者發(fā)現(xiàn)，和control相比，calcium-macrophages的mTORC1, S6 ribosomal protein (S6rp)和 ribosomal protein S6 kinase (p70S6K)的磷酸化/活化顯著下降。提示calcium- stimulated monocytes中mTORC1未活化。
Fig 7b, c： 一致的，calcium- stimulated monocytes中TFEB的核轉(zhuǎn)位增加。
Fig 7d-e： TFEB的靶基因分析顯示在分化成calcium-macrophages過程中，CLEAR (Coordinated Lysosomal Expression and Regulation) 基因網(wǎng)絡顯著上調(diào)，而且其上調(diào)在分化后7天也仍然存在。STAT3-signaling對于調(diào)節(jié)溶酶體平衡至關(guān)重要。底物超載促進溶酶體蛋白的 STAT3 依賴性轉(zhuǎn)錄，包括組織蛋白酶 B/D，作者發(fā)現(xiàn)其在 TFEB 靶基因中上調(diào)。
Fig 7f, g：使用 ImageStream 分析 STAT3 的細胞內(nèi)定位表明存在鈣誘導的 STAT3 核轉(zhuǎn)位。

Fig 7h：為了測試 TFEB 或 STAT3 是否參與鈣誘導的溶酶體增加，使用了 mTOR 激活劑 MHY1485（以促進 mTORC1 依賴性 TFEB 磷酸化和胞質(zhì)溶膠保留）和 STAT3 抑制劑 S3I-201。 兩者都導致抑制鈣誘導的 LAMP2-熒光增加，提示轉(zhuǎn)錄因子TFEB和STAT3都參與溶酶體蛋白表達和生物合成。
Fig 7i：在 THP-1 鈣巨噬細胞分化模型中，mTOR 激活劑 MHY1485 對 TFEB 核轉(zhuǎn)位的抑制導致部分抑制，而 S3I-201 對 STAT3 的抑制完全減弱了鈣巨噬細胞分化。

Discussion

該研究表明，細胞外鈣濃度的增加會導致 CPP 的形成和攝取，以及隨后單核細胞分化成巨噬細胞。值得注意的是，這個過程不需要額外的生長因子，如 GM-CSF 或 M-CSF。 鈣巨噬細胞具有獨特的形態(tài)表型，它們分化成needle like cells。 盡管 M1/M2 模型已經(jīng)過時 ，但作者在 GM-CSF 巨噬細胞中檢測到更多的促炎細胞因子和更少的抗炎 IL-10，而不是在 M-CSF 巨噬細胞中，兩者分別類似于“促炎 M1”巨噬細胞 和“愈合M2”巨噬細胞。scRNA-seq、DNA 微陣列、蛋白質(zhì)組學和功能分析結(jié)果顯示，和對照巨噬細胞相比，鈣巨噬細胞顯示出獨特的表型。 這種表型的特征包括needle like shape、過度的組成型 SPP1/骨橋蛋白產(chǎn)生、強烈的促炎細胞因子產(chǎn)生、抗炎介質(zhì)分泌的缺乏以及明顯的遷移潛力。 從 RA 患者的單核細胞中分化出來的鈣巨噬細胞顯示出這種表型的整體更強的表現(xiàn)。