間充質(zhì)干細(xì)胞屬于成體干細(xì)胞，在體外不同條件下誘導(dǎo)分化為骨、軟骨及其他結(jié)締組織，因其來源廣泛，分離無創(chuàng)傷，較低的免疫原性、生長(zhǎng)周期短等特點(diǎn)，是組織工程種子細(xì)胞的重要來源。干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化一方面是干細(xì)胞鑒定的主要方法，另一方面也是干細(xì)胞功能學(xué)研究的主要途徑。采用體外條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)下，人間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)能夠分化為成脂肪、骨、軟骨細(xì)胞。成脂分化經(jīng)油紅O染色法鑒定，成骨分化經(jīng)茜素紅染色法鑒定，成軟骨分化經(jīng)阿爾辛藍(lán)染色法鑒定。
迪醫(yī)明生物不僅可以提供不同來源間充質(zhì)干細(xì)胞、iPS細(xì)胞，配套培養(yǎng)含血清和無血清培養(yǎng)體系以及誘導(dǎo)成脂、成骨、成軟骨完全培養(yǎng)基、三系分化染色鑒定試劑盒，特別推薦您選擇間充質(zhì)干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)項(xiàng)目——成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)技術(shù)指導(dǎo)和誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)外包服務(wù)。
迪醫(yī)明生物干細(xì)胞系列產(chǎn)品檢測(cè)結(jié)果表明，細(xì)胞無細(xì)菌、真菌、霉菌、支原體和病毒污染，表達(dá)多種間充質(zhì)干細(xì)胞特異性標(biāo)記，具有良好的增殖和分化潛能，可分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等。
產(chǎn)品性能
1.細(xì)胞形態(tài)
2. 細(xì)胞表型
間充質(zhì)干細(xì)胞P20代細(xì)胞表型
流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表型
3.細(xì)胞誘導(dǎo)分化
3.1 成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)分化操作步驟
所需材料
0.05%Trypsin-0.02%EDTA（貨號(hào)：CD05-001C）
Phosphate-BufferedSaline (1×PBS) （貨號(hào)：BS01-001C）
間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基（貨號(hào)：CM01-001A）
間充質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基（貨號(hào)：DM01-001B）
間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基（貨號(hào)：DM02-001B）
間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基（貨號(hào)：DM03-001B）
成脂誘導(dǎo)分化步驟
注意：本操作規(guī)程以六孔板為例
1. 將間充質(zhì)干細(xì)胞置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2. 當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到達(dá)對(duì)數(shù)期時(shí)，用0.05%Trypsin-0.02%EDTA進(jìn)行消化。
3. 將消化下來的間質(zhì)干細(xì)胞按照2×104 cells/cm2的細(xì)胞密度接種在六孔板中，每孔加入2 mL完全培養(yǎng)基。
4. 將細(xì)胞置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
5. 每隔三天換液，直到細(xì)胞融合度達(dá)到100%或者過融合。
6. 小心地將間質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基吸走，向六孔板中加入2 mL間充質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基 A 液。
7. 誘導(dǎo)3天后，吸走六孔板中的A液，加入2 mL間充質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基B液。
8. 24h后，吸走B液，換回A液進(jìn)行誘導(dǎo)。
9. A液和B液交替作用3-5次后（12-20天），繼續(xù)用 B 液維持培養(yǎng)4-7天直到脂滴變得足夠大、圓。B 液維持培養(yǎng)期間，每隔2-3天需要換用新鮮的B液。
成脂（油紅O染色） 成骨（茜素紅染色）
成骨誘導(dǎo)分化步驟
注意：本操作規(guī)程以六孔板為例
1. 將間充質(zhì)干細(xì)胞置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2. 當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80-90%時(shí)，用0.05%Trypsin進(jìn)行消化。
3. 將消化下來的間充質(zhì)干細(xì)胞按照2×104 cells/cm2 的細(xì)胞密度接種在事先包被0.1%明膠的六孔板中，每孔加入2 mL完全培養(yǎng)基。。
4. 將細(xì)胞置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
5. 當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到60%-70%時(shí)，小心的將孔內(nèi)完全培養(yǎng)基吸走，向六孔板中加入2 mL間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基。
6. 每隔3天換用新鮮的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基（使用前需預(yù)熱至37℃）
7. 誘導(dǎo)2-4周后，視細(xì)胞的形態(tài)變化及生長(zhǎng)情況，用茜素紅進(jìn)行染色。
注意：為防止成骨細(xì)胞脫落，建議成骨過程中出現(xiàn)大量鈣結(jié)節(jié)之后，換液形式變?yōu)槊績(jī)商煲淮伟肓繐Q液。
成軟骨誘導(dǎo)分化步驟
1. 進(jìn)行成軟骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)之前，需要對(duì)常規(guī)消化后的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
2. 將3-4×105個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，250 g離心4 min。
3. 吸去上清，加入0.5 mL預(yù)混液，重懸上一步離心所得沉淀，以清洗間充質(zhì)干細(xì)胞，室溫下150 g離心5 min。
4. 重復(fù)步驟3，再次清洗細(xì)胞。
5. 將上一步所得沉淀用0.5 mL間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基重懸。
6. 室溫下150 g離心5 min。
7.擰松離心管蓋以便于氣體交換，將其放置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
注意：
① 此步驟不要吸掉上清和重懸細(xì)胞。
② 24 小時(shí)之內(nèi)不要搖動(dòng)離心管。
8. 當(dāng)細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)聚攏現(xiàn)象時(shí)（一般為24 h或48 h后，實(shí)際視細(xì)胞生長(zhǎng)情況而定）輕彈離心管底部使軟骨球脫離管底懸浮在液體中。
9. 自接種開始計(jì)算，每隔2-3 d 給細(xì)胞換用新鮮的成軟骨誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基，每管約0.5 mL成軟骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基。
注意：小心操作，不要吸出軟骨球。
10.換液之后，輕彈離心管底部使軟骨球脫離管底懸浮在液體中。稍加擰松離心管蓋放入37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)。
11.一般持續(xù)誘導(dǎo)21-28天后，可對(duì)軟骨球進(jìn)行福爾馬林固定和石蠟包埋切片，最后進(jìn)行阿利辛藍(lán)染色。
成軟骨（阿利新藍(lán)染色）
