CRISPR/Cas9 系統(tǒng)作為細(xì)菌和古細(xì)菌的獲得性免疫系統(tǒng)， 通過 RNA 介導(dǎo)特異性的切割外源遺傳物質(zhì)， 用以對(duì)抗入侵的病毒和質(zhì)粒。利用 Cas9 來摧毀入侵 DNA 的 Type Ⅱ CRISPR/Cas 系統(tǒng)， 可以在體外進(jìn)行基因的編輯。
為了提高CRISPR/Cas9 的特異性，使用 Cas9 切口酶和一對(duì) sgRNA，兩個(gè)相近的切口造成 DNA 雙鏈斷裂， 誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生非同源末端連接修復(fù)， 造成目的基因的突變。
利用 CRISPR/Cas9 進(jìn)行基因的編輯，首先要構(gòu)建有效的 sgRNA。一般地，基因特異的 sgRNA 模板序列為位于 PAM 序列（Protospacer Adjacent Motif）前間區(qū)序列鄰近基序。這是一種見于 crRNA 分子的短核苷酸基序，可以被 Cas9 蛋白特異性識(shí)別并切割的 20 個(gè) nt。 而 PAM 序列的特征為 NGG（其中 N 為任意核苷酸）
01
****找敲除目的基因的外顯子****
根據(jù)目的基因選擇待敲除靶基因位點(diǎn)找出敲除目的基因的外顯子。 首先在第一個(gè)起始密碼子 ATG 之后的外顯子中找出特異性高的上下游序列。以小鼠基因 Th 為例。在 pubmed 上找到基因的 mRNA 的 CDS 區(qū)，選擇第二個(gè)外顯子作為敲除位點(diǎn)。
02
****設(shè)計(jì)成對(duì) sgRNA 序列****
打開網(wǎng)站 http://crispr.mit.edu，將基因名稱，郵箱，第二外顯子序列輸入到對(duì)話框，點(diǎn)擊 Agree and submit，等待網(wǎng)站設(shè)計(jì)成對(duì)的 sgRNA 序列。一般推薦網(wǎng)站設(shè)計(jì)，因?yàn)榫W(wǎng)站可以預(yù)測(cè)脫靶位點(diǎn)數(shù)，避免基因脫靶產(chǎn)生。當(dāng)然也可以手動(dòng)選擇特異的 sgRNA 序列。
設(shè)計(jì)成對(duì)的 sgRNA 序列。打開 Nickase analysis，如圖所示，網(wǎng)站會(huì)給出多組成對(duì) sgRNA 序列，如箭頭所示，并且預(yù)測(cè)可能脫靶數(shù)。
03
****分析成對(duì) sgRNA 序列****
打開 http://www.oligoevaluator.com，將 sgRNA 輸入，點(diǎn)擊 Calcute，得到基因分析。綜合考慮 Tm（56~62）、GC content （45～60%） 及 secondary structure 來最終確定適宜的 sgRNA 序列，因此，高 score 的序列不一定是最佳序列。
如圖，第一對(duì) 81 分的序列，Tm 值大于 62 度，而且存在穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)，所以并不推薦。所以應(yīng)該從上述成對(duì)序列中繼續(xù)尋找合適成對(duì) sgRNA 序列。
04
****根據(jù)找到的合適的 sgRNA 訂購(gòu) oligo****
圖為 U6 真核表達(dá)載體設(shè)計(jì)，F(xiàn)orward oligo:5'-ACGG, Reverse oligo:5'-AAAC。
05
****關(guān)于 cas9 的幾個(gè)注意事項(xiàng)****
CRISPR-cas9 最主要的要求：PAM 序列為 NGG。
sgRNA，即 cas9 guide RNA，是引導(dǎo) cas9 蛋白在基因編輯位點(diǎn)進(jìn)行定向切割，所以一般是 20 個(gè)堿基，不含 PAM 序列。
設(shè)計(jì)的 sgRNA 一定有效嗎？一般設(shè)計(jì)好的 sgRNA 會(huì)在細(xì)胞水平驗(yàn)證下 DNA 水平的編輯效率，通過對(duì)細(xì)胞 DNA 序列測(cè)序以及 T7EN1 酶切驗(yàn)證敲減效率。對(duì)于目的基因，更主要的是驗(yàn)證蛋白基因 mRNA 水平進(jìn)行驗(yàn)證。
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cas9 的相關(guān)應(yīng)用：
（1）敲減細(xì)胞，可以選擇 lenti-crisprv2 系統(tǒng)，通過包裝慢病毒，可對(duì)目的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并不斷藥篩得到穩(wěn)定敲減細(xì)胞系。
（2）構(gòu)建基因敲除編輯鼠。根據(jù)染色體修復(fù)方式又可分為 knockout 與 knockin 兩種形式。
