細(xì)胞培養(yǎng)的概念

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)又稱細(xì)胞克隆技術(shù)，是指將活體組織或細(xì)胞從試驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)取出，放在模擬體內(nèi)生存環(huán)境的體外環(huán)境中（無菌、適當(dāng)溫度及酸堿度和一定營(yíng)養(yǎng)條件），使其生長(zhǎng)繁殖，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在生物、醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用。

體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型

機(jī)體取出的組織細(xì)胞的首次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)，一般持續(xù)1-4周；原代培養(yǎng)形成的單層細(xì)胞匯合以后,需要進(jìn)行分離培養(yǎng)，此過程稱為傳代培養(yǎng)。

貼附型細(xì)胞主要分為以下幾個(gè)類型：成纖維細(xì)胞型；上皮型細(xì)胞；游走細(xì)胞型；多型細(xì)胞型。懸浮型的則見于少數(shù)特殊的細(xì)胞，如某些類型的癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞等。

細(xì)胞培養(yǎng)的條件

在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，應(yīng)根據(jù)離體細(xì)胞的特點(diǎn)和培養(yǎng)條件，提供滿足其生長(zhǎng)和發(fā)育的一些基本生理?xiàng)l件：

1、必須保證在無菌條件下進(jìn)行。細(xì)胞感染微生物后，會(huì)因被奪營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢或停滯，甚至死亡。

2、需要提供適宜的溫度和CO2濃度。一般哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的溫度控制在37℃，魚類的溫度要低一些。溫度過高或過低，均不利于細(xì)胞生長(zhǎng)甚至?xí)?dǎo)致細(xì)胞死亡。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中需要提供一定量的氣體（O2和CO2）。CO2具有調(diào)節(jié)pH和緩沖的作用，一般提供5% CO2。

3、細(xì)胞離體培養(yǎng)技術(shù)的關(guān)鍵是細(xì)胞培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)基中需含有細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)所需要的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如提供能量的物質(zhì)（N源、C源）、代謝調(diào)節(jié)控制的物質(zhì)（無機(jī)鹽、維生素、激素）。理想的細(xì)胞培養(yǎng)液可以同時(shí)滿足細(xì)胞離體培養(yǎng)所需要的pH、滲透壓、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、調(diào)節(jié)物質(zhì)等的全部需要。動(dòng)物細(xì)胞最適宜pH一般控制在7.2~7.4，在此范圍細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，增殖速度快，如果PH過低或過高，細(xì)胞將因?yàn)榧?xì)胞膜受損而死亡。

細(xì)胞培養(yǎng)的一般過程

1、準(zhǔn)備工作?準(zhǔn)備工作對(duì)開展細(xì)胞培養(yǎng)異常重要，工作量也較大，應(yīng)給予足夠的重視，準(zhǔn)備工作中某一環(huán)節(jié)的疏忽均可導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)的失敗。準(zhǔn)備工作的內(nèi)容包括器皿的清洗、干燥與消毒，培養(yǎng)基與其他試劑的配制、分裝及滅菌，無菌室或超凈臺(tái)的清潔與消毒，培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調(diào)試等。

2、取材?在無菌環(huán)境下從機(jī)體取出某種組織細(xì)胞（視實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ǎ?jīng)過一定的處理（如消化分散細(xì)胞、分離等）后接入培養(yǎng)器皿中，這一過程稱為取材（如是細(xì)胞株的擴(kuò)大培養(yǎng)則無取材這一過程）。

3、培養(yǎng)?將取得的組織細(xì)胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程稱為培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)，一般應(yīng)在接入培養(yǎng)器皿之前進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按要求以一定的量（以每毫升細(xì)胞數(shù)表示，由所養(yǎng)細(xì)胞決定具體量）接入培養(yǎng)器皿并直接加入培養(yǎng)基。細(xì)胞進(jìn)入培養(yǎng)器皿后，立即放入恒溫培養(yǎng)箱中，正在培養(yǎng)中的細(xì)胞應(yīng)每隔一定時(shí)間觀察一次，觀察細(xì)胞是否生長(zhǎng)良好，形態(tài)是否正常，有無污染，培養(yǎng)基的PH是否正常（由酚紅指示劑指示），此外對(duì)培養(yǎng)溫度和CO2濃度也要定時(shí)檢查。

注意：培養(yǎng)細(xì)胞的密度要根據(jù)細(xì)胞的特性及傳代的時(shí)間等來定，無論傳代與否，培養(yǎng)基最好不要超過2天就要更換一次。

4、凍存及復(fù)蘇?為了保存細(xì)胞，特別是不易獲得的突變型細(xì)胞或細(xì)胞株，要將細(xì)胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度-196℃，將細(xì)胞收集至凍存管中加入含保護(hù)劑（一般為二甲亞砜或甘油）的培養(yǎng)基，以一定的冷卻速度凍存，最終保存于液氮中。在極低的溫度下，細(xì)胞保存的時(shí)間幾乎是無限的。

復(fù)蘇一般采用快融方法，即從液氮中取出凍存管后，立即放入37℃水浴鍋中，使之在一分鐘內(nèi)迅速融解，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)器皿中進(jìn)行培養(yǎng)。

注：凍存過程中保護(hù)劑的選用、細(xì)胞密度、降溫速度及復(fù)蘇時(shí)溫度、融化速度等都對(duì)細(xì)胞活力有影響。