師姐我想請問一下，嘌呤霉素篩選多久后做t7酶切啊，我每次都是篩選兩天消化下來然后提dna，跑pcr酶切。三次了設(shè)計了7個sgrna沒一次有任何一個被切開，是不是篩選后還要配養(yǎng)一段時間等cas9發(fā)揮作用啊
CRISPR-Cas9基因編輯5--不可或缺的sgRNA活性預(yù)實驗前言： 大家都知道CRISPR-Cas9有脫靶效應(yīng)，并且每個sgRNA的效率都不一樣的，因此在做正式實驗之前，我們要驗證sgRNA的效率，之后優(yōu)中選優(yōu)。還是那句話，同樣的目的...
好的，謝謝春卷姐
CRISPR-Cas9基因編輯3--sgRNA-Cas9質(zhì)粒構(gòu)建簡介和前期文章 我對之前的所有教程進(jìn)行了再次詳細(xì)的總結(jié)CRISPR-Cas9基因編輯之背景介紹及gRNA設(shè)計（上）[http://m.itdecent.cn/p/e5c...
我沒有T4 PNK，第一步加T4 連接酶是不是也行
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春卷師姐新年好，我用你的方法做了好幾次。質(zhì)粒用的是新買的PX458和PX459,用的酶是NEB的BbsI-HF的快酶，感受態(tài)細(xì)胞用了Stbi3和DH5α都用過了，每次長得菌都不少，但是一次挑10幾個單克隆，設(shè)計引物測序都只能測出空載。不知道為什么sgRNA老是掛不上去呢，是不是BbsI-HF沒加rCutSmart。或者是我第一步有點不一樣，我們PCR儀沒辦法每分鐘下降5℃，我最慢只能每分鐘下降6℃，是不是這個原因?qū)е碌哪亍?
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