文獻(xiàn)鏈接：Spatial epigenome–transcriptome co-profiling of mammalian tissues
發(fā)表期刊：Nature
影響因子：49.962
發(fā)表時間：2023年3月新興的空間組學(xué)技術(shù)（包括空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和空間表觀基因組學(xué)），正在成為分析組織中細(xì)胞狀態(tài)的有力工具。不過目前的技術(shù)手段都僅僅從單個組學(xué)的維度來解決問題，在這里作者將兩種技術(shù)結(jié)合在一起實現(xiàn)空間水平上同一組織切片上的染色質(zhì)可及性和基因表達(dá)分析。實驗材料：小鼠胚胎（E13）、幼年小鼠腦、成人大腦海馬體，用來繪制表觀遺傳機(jī)制如何控制組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)特性和細(xì)胞動力學(xué)研究。
0. 技術(shù)流程和數(shù)據(jù)質(zhì)控
0.1 實驗原理與操作步驟
- step1：冷凍的組織切片用甲醛固定后，使用偶聯(lián)DNA linker序列的Tn5轉(zhuǎn)位復(fù)合物處理（DNA linker序列為一段已知堿基的序列，用于后續(xù)PCR擴(kuò)增），該復(fù)合物會將linker序列插入到開放的染色質(zhì)區(qū)域
- step2：組織切片與含有生物素標(biāo)記的DNA序列（ 包含universal ligation linker和poly T序列）孵育，目的是與mRNA的polyA尾巴結(jié)合并完成逆轉(zhuǎn)錄攜帶universal ligation linker
- step3：將組織切片放置于微流控通道陣列芯片，引入空間條形碼Ai (i?=?1?50 or 100)
-
step4：使用另一個垂直于第一個流動方向的通道芯片引入空間條形碼Bj（j=1?50 or./ll100）
Ai 和 Bj 為表觀遺傳組和轉(zhuǎn)錄組的空間條形碼，最終逆轉(zhuǎn)錄獲得的大片段cDNA（來源于轉(zhuǎn)錄組）通過鏈霉親和素磁珠富集，gDNA（來源于表觀遺傳組）直接通過富集上清完成。兩類DNA序列最終構(gòu)建NGS文庫用于測序。
0.2 實驗設(shè)計
| 樣本類型 | pixel size | total pixel number | 切片面積 | 實驗類型 |
|---|---|---|---|---|
| 第13天小鼠胚胎（E13） | 50um | 2500 | 2.5mm x 2.5 mm | RNA, ATAC |
| 小鼠出生后第21/22天大腦（P21/22） | 20um | 10000 | 2mm x 2mm | RNA, ATAC, Cut&Tag (H3K27me3, H3K27ac, H3K4me3) |
| 成人大腦海馬體 | 50um | 2500 | 2.5mm x 2.5 mm | RNA, ATAC |
0.3 數(shù)據(jù)質(zhì)控
使用 2mm x 2mm（pixel size 20um; total number 10000）可以剛好覆蓋P22小鼠腦冠狀面的整個半球：
- ATAC 數(shù)據(jù)：每個pixel的中位 unique fragments 為14284（其中19%富集于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，26%位于峰值）如圖1b
- Cut&Tag 數(shù)據(jù)：每個pixel的unique fragments中位值10644（H3K27me3）、10002（H3K27ac）和2507（H3K4me3），其中12%（H3K27me3）、17%（H3K27ac）和67%（H3K4me3）與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)重疊，12%(H3K21%（H3K27ac）和54%（H3K4me3）分別位于峰值如圖1b
-
RNA 數(shù)據(jù)：總計22914 genes檢出，平均每個pixel 的gene檢出1073，UMI檢出2358 如圖1c
在RNA數(shù)據(jù)中，共檢測到25881個（H3K27me3）、23415個（H3K27ac）和22731個（H3K4me3）基因，平均每像素2011個（H3K27me3）、1513個（H3K27ac）和133K4me3)基因（4734個（H3K27me3）、3580個（H3K27ac）和2885個（H3K4me3）UMIs（圖1c））。
1. 小鼠胚胎的空間多組學(xué)共分析
E13小鼠胚胎 Spatial ATAC-RNA-seq共鑒定了8個主要的ATAC cluster和14個RNA cluster，表明在該發(fā)育階段，單獨(dú)做染色質(zhì)可及性的分析不能進(jìn)行準(zhǔn)確的細(xì)胞類型區(qū)分。
ATAC數(shù)據(jù)分析：圖1d左 & 圖1e上
- A3代表胚胎的眼部，表現(xiàn)為Six6 基因位點(diǎn)上的染色質(zhì)可及性
- A4-A5簇與幾個發(fā)育中的內(nèi)部器官有關(guān)
- A6-A7簇覆蓋中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）
RNA數(shù)據(jù)分析：圖1d中
- R10（Six6）與胚胎眼相關(guān)
- R2、R6和R8與中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)
- R7與軟骨的形成有關(guān)
（1）ATAC-RNA數(shù)據(jù)整合細(xì)化空間格局： 如圖1d右，在聯(lián)合據(jù)類分析中發(fā)現(xiàn)了一個新的神經(jīng)元簇（J10），它不能通過單一的ATAC或RNA的數(shù)據(jù)分析來獲得，這一結(jié)果強(qiáng)調(diào)了使用聯(lián)合多組學(xué)來改進(jìn)空間細(xì)胞類型映射的價值。
（2）ATAC-RNA數(shù)據(jù)整合有助于研究組織環(huán)境中染色質(zhì)可及性峰與基因表達(dá)間的相關(guān)性：例如，一些marker基因（Pax6、Sox2和Myt1l）在胚胎腦的某些區(qū)域表現(xiàn)為高度可及性，但是其對應(yīng)mRNA表達(dá)卻相對較低。
（3）空間ATAC-RNA數(shù)據(jù)整合，可以用于解讀組織發(fā)育過程中的基因調(diào)控機(jī)制和時空動態(tài)：為了研究胚胎發(fā)育過程中染色質(zhì)可及性與基因表達(dá)之間的時空關(guān)系，作者分析了從徑向膠質(zhì)細(xì)胞向有絲分裂后早衰神經(jīng)元等不同類型神經(jīng)元的分化軌跡。將ATAC數(shù)據(jù)進(jìn)行空間水平的擬時序分析，發(fā)育軌跡在空間組織中可以直接可視化（圖1f）。染色質(zhì)可及性GAS和沿著該發(fā)育軌跡的基因表達(dá)熱圖顯示了marker基因的動態(tài)變化。與預(yù)期一樣，Sox2、Pax6和其他參與祖細(xì)胞維持和增殖的基因在向有絲分裂后的神經(jīng)元過渡的過程中表達(dá)水平下調(diào)。Pax6和徑向膠質(zhì)標(biāo)記物Fabp7位點(diǎn)染色質(zhì)可及性的缺失導(dǎo)致于相應(yīng)mRNA表達(dá)的下調(diào)（圖1h）。
2. 小鼠大腦的空間ATAC-RNA-seq
如圖2a，作者開發(fā)了一個具有100個蛇形微通道的芯片（實現(xiàn)一張芯片做5個樣本的目的），這里將組織切片分割為100 x 100條形碼標(biāo)記的區(qū)域（即，將組織切片分割為10000個小區(qū)域），像素大小20um。
P22小鼠大腦冠狀面切片，通過該芯片用于染色質(zhì)可及性與轉(zhuǎn)錄組的聯(lián)合分析。不同于前面E13小鼠胚胎腦的分析，這里在ATAC數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)了14個cluster，mRNA分析11個cluster。幼年小鼠大腦中終端分化的大多數(shù)主要細(xì)胞類型相對于胚胎而言包括了很多未分化或多能的細(xì)胞狀態(tài)（如2b）。
- ATAC 數(shù)據(jù)分析：通過marker基因可以確定組織區(qū)域（圖2c,圖2e上）
- RNA 數(shù)據(jù)分析：通過marker基因可以確定組織區(qū)域（圖2d,圖2e下）
整合分析發(fā)現(xiàn)：ATAC與RNA所決定的空間細(xì)胞類型分布具有高度的一致性，這表明染色質(zhì)可及性和轉(zhuǎn)錄組在定義組織細(xì)胞身份方面存在普遍的一致性（圖2c-d），例如神經(jīng)元中間祖細(xì)胞、成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞、新形成的少突膠質(zhì)細(xì)胞和中棘神經(jīng)元（MSN）在ATAC數(shù)據(jù)確定的相同區(qū)域富集。
與小鼠胚胎腦中觀察一致的是，一些具有開放染色質(zhì)可及性的標(biāo)記基因（Sox10、Sox2、Neurod6、Pax6和Notch1）要么不表達(dá)，要么低表達(dá)（圖2e）。這些基因中有許多參與編碼神經(jīng)發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子，表明這些基因在大腦發(fā)育過程中可能存在表觀遺傳記憶，而不是轉(zhuǎn)錄記憶。
3. 小鼠腦的空間CUT&Tag-RNA-seq
除了染色質(zhì)可及性外，組蛋白修飾也是表觀遺傳調(diào)控的一個關(guān)鍵方面。作者采用空間CUT&Tag-RNA-seq分別對P22小鼠大腦的轉(zhuǎn)錄組和H3K27me3（抑制位點(diǎn)）、H3K27me3（激活啟動子和/或激活子）或H3K4me3（激活啟動子）組蛋白修飾進(jìn)行共譜分析（20μm像素大小，100×100）。
CUT&Tag-RNA-seq共分析更清晰得鑒定細(xì)胞狀態(tài)：通過H3K27me3和RNA數(shù)據(jù)分別鑒定了11和12個cluster。同時，CUT&Tag與RNA在空間格局上具有良好的一致性（圖3a-c）。整合空間CUT&Tag和scCUT&Tag數(shù)據(jù)（圖3d、e）表明，H3K27me3、H3K27ac和H3K4me3數(shù)據(jù)的表觀遺傳狀態(tài)與scCUT&Tag對應(yīng)的投影一致。表觀基因組模式中的幾個簇（簇C0、C1和C3）、scRNA-seq數(shù)據(jù)與來自同一組織切片的配對RNA數(shù)據(jù)的marker清楚地顯示了這些cluster中的細(xì)胞身份（圖3a、d），突出了在同一組織切片中結(jié)合CUT&Tag和RNA-seq（空間CUT&Tag-RNA-seq）的分析，可以更準(zhǔn)確地識別細(xì)胞類型或狀態(tài)。
4. 區(qū)域特異性基因表達(dá)調(diào)控
為了進(jìn)一步了解基因組尺度上基因表達(dá)的空間表觀遺傳調(diào)控，作者比較了ATAC和CUT&Tag（H3K27me3、H3K27ac、H3K4me3）獲得的GAS 或 CSS與P22小鼠大腦所有主要組織區(qū)域相應(yīng)的RNA表達(dá)（圖4a-c），包括胼胝體、紋狀體和淺層、更深的皮質(zhì)層，圖4主要展示具有代表性的胼胝體。
（1）H3K27me3和RNA的逆向相關(guān)性：在少突膠質(zhì)細(xì)胞豐富的胼胝體中，我們觀察到H3K27me3和RNA之間存在強(qiáng)大的抗作用相關(guān)性（圖4a）。低CSS和高RNA表達(dá)的Mal、Mag和Car2等基因?qū)?yīng)髓鞘形成與少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的調(diào)控；相比之下，高CSS和低RNA表達(dá)的基因如Grin2b和Syt1與突觸傳遞和神經(jīng)遞質(zhì)釋放等神經(jīng)元過程有關(guān)；同時還有一個小的基因集在胼胝體中具有 H3K27me3和RNA的共同高表達(dá)，如Ptprz1，這是一種少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞的標(biāo)記物，這也可能部分是由于胼胝體中少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞（表達(dá)Ptprz1）和成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞（Ptprz1被抑制）的鄰近存在。盡管RNA表達(dá)和H3K27me3沉積之間存在普遍的抗性作用，但是也可以在圖4d中觀察到區(qū)域差異。
（2）“H3K4me3或H3K27ac”和RNA的逆向相關(guān)性：與H3K27me3相比，我們觀察到RNA與胼胝體中激活標(biāo)記H3K4me3或H3K27ac之間的強(qiáng)大相關(guān)性，基因在少突膠質(zhì)細(xì)胞中以這兩種方式高表達(dá)和高沉積（圖4b、c)。
（3）胼胝體中不同組蛋白修飾之間的集體調(diào)控：H3K4me3和H3K27ac普遍呈高度相關(guān)，其信號與H3K27me3不相關(guān)（圖4e）。我們還觀察到H3K4me3或H3K27ac和H3K27me3在該組織區(qū)域的幾個基因位點(diǎn)上共同占據(jù)(圖4e)。這些基因參與了少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化和髓鞘化，以及其他過程，如蛋白質(zhì)的分解代謝和定位。其中一些基因，如Ptprz1和Fnbp1，也表現(xiàn)出較高水平的H3K27me3和RNA表達(dá)（圖4a）。如上所述，這種潛在的H3K4me3/H3K27me3二價性可能反映了轉(zhuǎn)錄平衡。
5. 人腦海馬體的空間映射
作者對成人（31歲男性）大腦海馬體進(jìn)行了空間ATAC-RNA-seq（這是一個復(fù)雜的大腦區(qū)域，涉及認(rèn)知功能和重度抑郁癥、阿爾茲海默癥等相關(guān)疾?。?。ATAC 數(shù)據(jù)分為7個亞群，RNA數(shù)據(jù)分為8個亞群，其空間格局與解剖標(biāo)志物（圖5a）一致。
（1）ATAC數(shù)據(jù)分析：A4對應(yīng)顆粒細(xì)胞層（GCL）：THY1，BCL11B；A6對應(yīng)于脈絡(luò)叢（圖5a，d）
（2）RNA數(shù)據(jù)分析：作者檢測到了具有獨(dú)特標(biāo)記基因的不同簇（圖5a，d），如在簇R4（GCL）中富集的PROX1和BCL11B。
（3）整合ATAC數(shù)據(jù)和來自人腦樣本的scATAC-seq數(shù)據(jù)：RNA數(shù)據(jù)與成人大腦snRNA-seq數(shù)據(jù)對比，并將空間數(shù)據(jù)映射到對應(yīng)的單細(xì)胞測序分群中（圖5b）?？梢钥吹筋w粒細(xì)胞（GC）僅在GCL中檢出，氨角神經(jīng)元（CA）在CA3-4富集，脈絡(luò)叢中的血管軟腦膜細(xì)胞（VLMC）與其他區(qū)域顯著不同。
（4）多組學(xué)分析的優(yōu)勢：一般來說，ATAC和RNA的數(shù)據(jù)都可以做到該區(qū)域的細(xì)胞分群，但是單一的ATAC和轉(zhuǎn)錄組恐怕無法提供動態(tài)基因調(diào)控機(jī)制的新見解（多組學(xué)共分析可以做到）。例如，POX1（錐體神經(jīng)元的 marker gene）在顆粒細(xì)胞層（GCL）顯著高表達(dá)，但是染色質(zhì)可及性為中等。這可能是由于在有絲分裂后成熟的顆粒細(xì)胞中，對合成新的PROX1轉(zhuǎn)錄本的需求最小，因此不需要維持一個活躍的開放染色質(zhì)狀態(tài)。
Post script：證明了ATAC或CUT&Tag可以與RNA一起用于空間多組學(xué)定位。有可能結(jié)合所有三個染色質(zhì)可及性、組蛋白修飾和轉(zhuǎn)錄組來描繪一個更全面的組織基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的景觀。本文所報道的空間多組學(xué)可能會在神經(jīng)科學(xué) 和 發(fā)育生物學(xué)之外得到廣泛的應(yīng)用。人類疾病組織空間映射的多種模式不僅相互交叉驗證，而且更好地闡明了驅(qū)動異常細(xì)胞狀態(tài)的機(jī)制，而單模式方法難以識別?？臻g信息可能進(jìn)一步顯示局部組織環(huán)境如何影響細(xì)胞狀態(tài)、動態(tài)和功能。
