一、梗死心臟中巨噬細(xì)胞的時(shí)空動(dòng)力學(xué)和Trem2hi巨噬細(xì)胞的潛在功能
前幾天Online的一篇NC，做的是心梗的單細(xì)胞+空轉(zhuǎn)。
看完感覺(jué)這篇文章和同期online的做心梗單細(xì)胞+空轉(zhuǎn)的這篇nature人類MI的空間多組學(xué)圖譜之間的差距，得有100篇NC吧...（這篇實(shí)屬單細(xì)胞套路文章）
1. Immune cell dynamics after MI
Fig 1a：對(duì)正常、心梗d1、d3、d5、d7的心臟進(jìn)行了了流式分選，得到cd45+的免疫細(xì)胞，進(jìn)行了單細(xì)胞測(cè)序 (每組一個(gè)樣品)。
Fig 1b, c：一共得到33977個(gè)細(xì)胞，注釋得到12個(gè)細(xì)胞群。
Fig 1d：細(xì)胞比例結(jié)果顯示正常心臟中巨噬細(xì)胞最多，MI后1天中性粒細(xì)胞出現(xiàn)明顯增多，隨后又逐漸減少。巨噬細(xì)胞在1天時(shí)減少，隨后逐漸增多。
對(duì)比下面兩篇，這一篇送的時(shí)間點(diǎn)只有Inflammatory phase和Proliferative phase
2. Spatiotemporal profiles of immune cells after MI
Fig 2a：作者對(duì)心梗d1、d3、d5、d7的心臟進(jìn)行了空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。
Fig 2b, c：聚類得到5個(gè)cluster。梗死灶的中性粒細(xì)胞在d1時(shí)最多，隨后逐漸減少，而巨噬細(xì)胞則持續(xù)增多。
3. The heterogeneity of monocytes and macrophages and their temporal dynamics after MI
這部分對(duì)單核細(xì)胞的單細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行了重新聚類，得到16個(gè)cluster，查看了一下marker基因和比例變化。
將細(xì)胞主要分為了如下幾類：
steady-state macrophage (
SS-Mφ): 1, 3, 13
Ly6c2hi monocytes/Early-Mφ: 4,10,14
Transient-Mφ：7, 8, 12
Late-Mφ: 2,5
IFN-Mφ: 6, 15
proliferating macrophages: 9, 11
non-classical monocytes: 16
4. Single-cell trajectories in the infarcted heart
對(duì)所有的單核巨噬細(xì)胞做了擬時(shí)序分析，找到一些擬時(shí)相關(guān)基因。Early-Mφ 特異性基因如Ccr2, Chil3, 和 Clec4e的表達(dá)，在Ly6c2hi monocytes/Early-Mφ中上調(diào)，隨后在Transient-Mφ重下調(diào)，在Late-Mφ 中處于一個(gè)較低水平。與之相反，Late-Mφ-特異性基因比如 Trem2, Rgs10 和 Fcrls，在 Ly6c2hi monocytes/Early-Mφ中下調(diào)，然后在Transient-Mφ 和 Late-Mφ 中逐漸上升。
免疫組化查看了這些基因的定位，Trem2主要在梗死灶。
5. Neutrophil and DC subpopulations
對(duì)粒細(xì)胞和DC做了亞群細(xì)分，描述了一下比例變化。（跟主線毫無(wú)關(guān)系，完全可以放在附圖里）
6. The expression of Trem2 after MI
后面作者就直接關(guān)注了Trem2（是個(gè)比較火的靶點(diǎn)）
Trem2 is highly expressed by macrophages in the infarcted heart and sTrem2 is exclusively secreted from Trem2hi macrophages.
7. Trem2hi macrophages accumulating in injured hearts late after MI are anti-inflammatory
Trem2hi macrophages are dominant in the late phase of MI and possess anti- inflammatory characteristics.
8. Improvement of left ventricular remodeling after in vivo injection of soluble Trem2
給小鼠注射sTrem2可以改善心梗小鼠心臟功能
整個(gè)文章做的非常常規(guī)，也沒(méi)有用什么有意思的分析方法。但是Trem2這個(gè)靶點(diǎn)還是值得關(guān)注的。
近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明髓系來(lái)源的細(xì)胞在各種病理學(xué)中的核心作用。其中髓系細(xì)胞觸發(fā)受體2 （triggering receptor expressed on myeloid cells-2 TREM2）被認(rèn)為是病理性誘導(dǎo)的免疫信號(hào)樞紐。TREM2是多種配體的受體，這些配體大多是組織損傷的標(biāo)志。在生理狀態(tài)下中，TREM2的活性僅限在特定的組織中，而在病理狀態(tài)中，TREM2信號(hào)途徑成為感知組織損傷并抑制損傷的免疫信號(hào)樞紐。這些發(fā)現(xiàn)也激發(fā)了學(xué)術(shù)界和工業(yè)界的熱情，以探索調(diào)控TREM2活性的策略，并用于治療疾病的可能性。
Cell. 2020 Jun 11;181(6):1207-1217.
二、MI的動(dòng)態(tài)間質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)預(yù)測(cè)不同基因背景小鼠的心臟破裂風(fēng)險(xiǎn)
這一篇是2020年發(fā)在cell reports上的文章
1. Single-Cell Analysis Defines the Interstitial Cell Landscape Post-MI
Since the epicardium, the mesothelium covering the heart, is the major source (～80%) of cardiac fibroblasts in homeostasis，作者使用了C57BL/6J Wt1Cre;RosaZsGreenf/+小鼠。這種示蹤鼠的epicardial derivatives細(xì)胞(也就是心臟間質(zhì)細(xì)胞)都是綠色。
作者分選了con和心梗d1, 3, 5, 7, 14, 28的小鼠心臟中活的有核細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞測(cè)序。(炎癥期：d1, 3；增殖期：d5, d7；成熟期：d14, d28)
一共得到了36,847細(xì)胞，注釋得到16個(gè)主要的細(xì)胞群。其中ZsGreen+的細(xì)胞包括epicardium, SMC和FB I-III (5群，見E圖)。
細(xì)胞比例變化結(jié)果顯示心梗早期固有免疫細(xì)胞出現(xiàn)顯著聚集，1d時(shí)中性粒細(xì)胞達(dá)到peak。單核巨噬細(xì)胞在7天達(dá)到peak。成熟期主要以成纖維和內(nèi)皮為主。適應(yīng)性免疫細(xì)胞和血管/壁細(xì)胞比較穩(wěn)定。
Wt1在成年小鼠心臟的外膜表達(dá)，也在內(nèi)臟器官的間皮中表達(dá)，可用作譜系追蹤和標(biāo)記Wt1表達(dá)細(xì)胞，常用于研究心臟、精子的發(fā)育及肝損傷等。
2. Dynamics of Stromal Populations Involved in Scar Formation
為了進(jìn)一步探究stromal transition，作者將ZsGreen+的五群細(xì)胞提出來(lái)做了亞群細(xì)分，得到12群。其中3群(DC, IFN response, Epicardium)因?yàn)榛祀s了其他細(xì)胞，沒(méi)有納入后續(xù)分析。剩余的9群細(xì)胞，作者使用SPRING做了軌跡分析，并展示了9群的特異性通路。
??成纖維亞群注釋可以參考c圖
epicardial-derived fibroblasts (EpiDs): Dpep1, Lpl, Hsd11b1, Cxcl14
homeostatic epicardial derived fibroblasts (HEpiDs):
progenitor-like state fibroblasts (PLSs): Cd248, Pi16, Ly6a
late-resolution (LR) fibroblasts: Adamtls2, Cilp, Col8a1, Meox1
injury response (IR) fibroblasts: Mt1-2
endocardial-derived fibroblasts (EndD): Wif1, Dkk3
Fig 2d中看到EndD自己出現(xiàn)了一個(gè)分支，作者在homeostatic ventricles中做了一下驗(yàn)證。結(jié)果顯示marker基因DKK3在穩(wěn)態(tài)下就存在于冠脈血管周和瓣膜成纖維細(xì)胞周，提示EndD從內(nèi)皮轉(zhuǎn)分化成成纖維的亞群是胚胎起源的，不是疾病激活的。
前面驗(yàn)證了EndD群，這里驗(yàn)證了一下injury response (IR) fibroblasts群。這群細(xì)胞高表達(dá)Mt1-2，而且分泌多種細(xì)胞因子，參與多種信號(hào)通路。隨后作者使用免疫熒光驗(yàn)證了Mt1-2在基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)。
隨后，作者探究了Myofb, MFCs 和 LR在MI后的心室重塑中的作用。
Figure 2D中的結(jié)果顯示 EpiD ZsGreen+ 細(xì)胞和 Myofb 細(xì)胞存在一個(gè)線性分化關(guān)系。有3群Myofb被鑒定出來(lái)，包括主要存在于d3-d7的Myofb (Acta2, Cthrc1), ProlifMyofb (Acta2, Cthrc1, cell-cycle genes)和一群最近鑒定出來(lái)的主要存在于d14-d28成熟scar中的 matrifibrocytes。
Compared to Myofb, MFCs had reduced expression of genes associated with contractility (Acta2, Tagln, Tpm2, and Myl9) or ECM components (Timp1, Tnc, Cthrc1, and Col1a1), but expressed Comp and Angptl7 and Fbln1 and Cilp, supporting the transition to a less contractile, less secretory cell type producing components of a more stable, chondrogenic-like ECM.
為了可視化這些細(xì)胞間的關(guān)系，作者使用ACTA2和CTHRC1作為 Myofb的markers，使用SFRP2和CLU作為 MFC的markers，進(jìn)行了免疫熒光染色。Myofb主要在5-7天比較多，MFC則主要在d14-d28比較多。qPCR也驗(yàn)證了上面的結(jié)果。
3. Genetically Determined Factors Confer Resilience to Cardiac Rupture
不同品系的小鼠在相同處理下心臟的反應(yīng)性不同。作者探究了9種對(duì)MI具有不同反應(yīng)性的小鼠C57BL/6J or B6J (control), 129S1/SvlmJ or 129 (prone to hypertension), DBA/2J (prone to calcification), NOD/ShiLtJ (prone to type 1 diabetes), NZO/HlLtJ (obese), A/J (prone to muscular dystrophy), and three wild-derived strains (CAST/EiJ, WSB/EiJ, and PWK/PhJ)對(duì)MI的反應(yīng)性。其中129的rupture率(59%)最高，B6J小鼠只有(13%)。
為了探究rupture的機(jī)制，作者取了MI d3 (pre-rupture)的B6J和129小鼠的心臟間質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)行了單細(xì)胞測(cè)序。兩組間的細(xì)胞比例顯示Post-MI 129 心臟的 Myofb, ProlifMyofb 和 IR fibroblasts 比 B6J 要多。
和c57相比，d3的129 MI小鼠間質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)了3922個(gè)差異表達(dá)基因，a圖展示了差異分析富集到的通路。b-d圖展示了血管生成反應(yīng)、ECM沉積、急性期反應(yīng)和凝血三條通路中的關(guān)鍵基因的表達(dá)。這些基因在129 MI小鼠間質(zhì)細(xì)胞顯著升高。
In summary, the increased susceptibility of 129 hearts to rupture is associated with persistent coagulation and impaired fibrinolysis that increases instability in the injury site, which is also supported by the higher responsiveness to angiotensin.
三、單細(xì)胞測(cè)序揭示心梗后內(nèi)皮細(xì)胞可塑性和瞬時(shí)間質(zhì)活化
這一篇是21年的一篇NC，對(duì)心梗不同點(diǎn)的小鼠心臟的非心肌(包括內(nèi)皮和成纖維)進(jìn)行了單細(xì)胞測(cè)序，主要關(guān)注了內(nèi)皮細(xì)胞。
1. Kinetics of EC inflammation, survival, and proliferation.
作者對(duì)con和MI后d1, 3, 5, 7, 14和28的小鼠非心肌細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞測(cè)序。（和上面那篇的分組一模一樣哦），得到19群細(xì)胞 (4群內(nèi)皮，5群?jiǎn)魏司奘桑?群T，1群B，6群成纖維)。在MI 1w內(nèi)，內(nèi)皮和間質(zhì)細(xì)胞比例下降，免疫細(xì)胞增多。隨后作者對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的EC做了通路富集，發(fā)現(xiàn)早期缺氧通路活化，相關(guān)基因Hif1a, Ldha以及炎癥因子Il1b, Il6 和 Tnf在早期出現(xiàn)上調(diào)。而在d1-d7，內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化通路被富集到。細(xì)胞周期分析也顯示d3時(shí)候分裂期細(xì)胞增加，分裂期相關(guān)基因表達(dá)也增加。
2. ECs acquire a transient state of mesenchymal transition after MI.
隨后對(duì)EC細(xì)胞做了擬時(shí)序分析，得到5個(gè)state。
可以看到MI后d1和control相比，state 2出現(xiàn)了明顯增加。這一群的特異性基因和通路富集提示它與中性粒細(xì)胞脫顆粒和炎癥反應(yīng)有關(guān)。在MI后1-7天的時(shí)間里，state 4出現(xiàn)明顯增加，隨后又下降。這一群細(xì)胞主要富集到extracellular matrix，脂肪酸攝取信號(hào)通路則出現(xiàn)下調(diào)。state 4的特異性基因包括間質(zhì)基因，細(xì)胞周期基因和增殖基因如Col3a1, Fn1, Serpine1。
state 4的間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因在早期出現(xiàn)上調(diào)(d)，分選了con和AMI d3的cdh5細(xì)胞進(jìn)行bulk RNA測(cè)序也得到了一致的結(jié)論(e)。
當(dāng)對(duì)所有的EC(clusters 6, 7, 17, and 18)進(jìn)行分析的時(shí)候也發(fā)現(xiàn)了存在EC基因表達(dá)下降和間質(zhì)基因表達(dá)上升(f, g)。
This suggests that EC acquire a transient mesenchymal activation (EndMA) state in the first week after MI.
隨后作者對(duì)EC進(jìn)行了亞群細(xì)分，得到了間質(zhì)內(nèi)皮(4-6)和幼稚內(nèi)皮。間質(zhì)內(nèi)皮和幼稚內(nèi)皮都出現(xiàn)了早期MI后內(nèi)皮基因表達(dá)的丟失 (c) 和間質(zhì)基因表達(dá)的上升 (d) 。間質(zhì)內(nèi)皮細(xì)胞在d1-d7比例上升，state 4的細(xì)胞也主要是間質(zhì)內(nèi)皮細(xì)胞。
隨后作者通過(guò)免疫熒光檢測(cè)了心臟梗死后D3的內(nèi)皮間質(zhì)基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)表達(dá)增加。
isolectin B4染色評(píng)估新生血管情況
MI不同時(shí)間點(diǎn)心臟，示蹤鼠(內(nèi)皮綠色)和間質(zhì)marker Pdgfra共染，也提示早期間質(zhì)內(nèi)皮的增加。
為了證實(shí)間質(zhì)細(xì)胞可以revert to 內(nèi)皮細(xì)胞表型，作者使用了Col1a2-CreERT2;mT/mG 鼠進(jìn)行了collagen-tracing 研究 。小鼠在誘導(dǎo)MI后d3, 4, 5, 6,7 給了tamoxifen，28天的時(shí)候送了單細(xì)胞測(cè)序。結(jié)果顯示EC中存在GFP+細(xì)胞。提示Col1a2 traced cells can become transcriptionally similar to endothelial cells between day 7 and day 28 after infarction. 熒光結(jié)果也提示GFP陽(yáng)性細(xì)胞和內(nèi)皮marker Isolectin B4存在共表達(dá)。
3. Characterization of EndMA cells.
為了進(jìn)一步理解EndMA的特性，作者將表達(dá)間質(zhì)marker的EndMA+和不表達(dá)間質(zhì)marker的EndMA-細(xì)胞做了差異分析和功能富集。結(jié)果顯示EndMA細(xì)胞高表達(dá)間質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)基因。上調(diào)的通路包括extracellular matrix organization, Pdgf binding, collagen synthesis, and organization等。
此外兩組細(xì)胞間還出現(xiàn)了明顯的代謝差異。EndMA細(xì)胞高表達(dá)糖酵解相關(guān)基因，EndMA-細(xì)胞則高表達(dá)三羧酸循環(huán)和脂肪酸代謝相關(guān)基因。
對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的內(nèi)皮進(jìn)行分析也提示MI后d1的內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)明顯糖酵解基因的高表達(dá)，d3則轉(zhuǎn)化為三羧酸循環(huán)相關(guān)基因，documented an adaptation of EC metabolism during the time frame in which mesenchymal activation occurs.
4. Cdh5-lineage tracing confirms the transient nature of EndMA after MI
前面的數(shù)據(jù)表明，MI 在與 EndMA 相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞中誘導(dǎo)了短暫的代謝和表型轉(zhuǎn)換。 然而，在沒(méi)有譜系示蹤的情況下，我們可能錯(cuò)過(guò)了完全轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)表型并失去 EC 標(biāo)記基因表達(dá)的 EC。 為了表征 EC 的長(zhǎng)期命運(yùn)，作者使用了endothelial fate-mapped mT/mG reporter mice (Cdh5- CreERT2;mT/mG)，并對(duì)不同MI時(shí)間點(diǎn)的小鼠心臟非心肌進(jìn)行了單細(xì)胞測(cè)序，結(jié)果顯示他莫昔芬注射導(dǎo)致預(yù)期的 GFP 在內(nèi)皮細(xì)胞中的誘導(dǎo)(a-c)。
為了探究EndMA的動(dòng)力學(xué)，作者評(píng)估了不同時(shí)間點(diǎn)間質(zhì)marker在GFP+細(xì)胞中的表達(dá)。和預(yù)期的一致，GFP+Cdh5+的內(nèi)皮細(xì)胞在d3, d7的時(shí)候，間質(zhì)marker Col1a1, Col3a1和Serpine1表達(dá)出現(xiàn)明顯增加。但是有趣的是，在晚期d14, d28并沒(méi)有觀測(cè)到明顯的完全轉(zhuǎn)化的(不表達(dá)內(nèi)皮marker的) mesenchymal GFP+ 細(xì)胞的增加 (d)。
作者對(duì)GFP+細(xì)胞的重新聚類鑒定出了一群EndMA (cluster 6)，這群細(xì)胞高表達(dá)膠原但是低表達(dá)內(nèi)皮marker。這群細(xì)胞也是在d7比例更高，consistent with a transient mesenchymal transition of ECs after MI。
5. Mesenchymal transition is reversible in vitro.
前面的研究結(jié)果提示心梗后，內(nèi)皮細(xì)胞 transiently 獲得 reversible partial mesenchymal state。所以作者在體外驗(yàn)證了這個(gè)結(jié)論。
作者在體外將EC和TGF-β2共孵育了3天，然后撤回刺激。3天的TGF-β2孵育誘導(dǎo)EC表達(dá)了間質(zhì)marker calponin (CNN1) 和 SM22 (TAGLN)，孵育3天后撤銷TGF-β2的內(nèi)皮在d7時(shí)的間質(zhì)marker表達(dá)恢復(fù)到正常水平，而在1-7d持續(xù)孵育TGF-β2的內(nèi)皮則在d7時(shí)間質(zhì)marker的表達(dá)進(jìn)一步升高。（使用TGF-β1, IL-1β和L-NAME的組合來(lái)誘導(dǎo)內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化也得到了一致的效應(yīng)）
為了探究TGF-β2的干預(yù)是否引起了true fate change，作者分析了間質(zhì)基因的DNA甲基化情況。結(jié)果并沒(méi)有觀察到間質(zhì)基因COL4A1, TAGLN和CNN1在給予TGF-β2干預(yù)和撤退后出現(xiàn)了DNA甲基化，However, we observed a reversible demethylation of regulatory regions upon TGF-à2 stimulation (Supplementary Fig. 17d)。
These observations confirm that mesenchymal gene expression induced by several different protocols is reversible and is associated with changes in DNA methylation of regulatory regions.
