轉(zhuǎn)載自簡書作者：lurui 鏈接：http://m.itdecent.cn/p/043e011d9a26? 并加以修改，不做商業(yè)用途
LB全稱是left border??RB是right border, 一般標(biāo)有LB,RB的為雙源載體。LB和RB也就是說,在這兩個邊界的中間的部分就是在轉(zhuǎn)化植物時可以整合到植物基因組上的片段.
CRISPR包括兩個部分：一個向?qū)NA(gRNA)和一個非特異性CRISPR結(jié)合核酸內(nèi)切酶(CRISPR-associated endonumclease即Cas9)。向?qū)NA是一個短的合成RNA,由一段結(jié)合Cas9必需的scaffold序列和特定的約20nt的空載(spacer)或靶向(targeting)序列（靶位點）組成，其中靶向序列決定了用于修飾的基因靶標(biāo)。因此我們只需改變gRNA上的靶向序列即可改變Cas9的基因靶標(biāo)。CRISPR最初用于敲除各種細(xì)胞類型或生物體的靶向基因，但對Cas9酶的改造已經(jīng)將CRISPR的應(yīng)用擴(kuò)展到選擇性激活或抑制靶向基因或純化特定的DNA區(qū)域，甚至可以和熒光顯微結(jié)合用于展現(xiàn)活細(xì)胞中的DNA。
使用CRISPR/Cas9進(jìn)行敲除
通過靶向基因特異的gRNA和核酸內(nèi)切酶Cas9的共表達(dá)，CRSIPR/Cas9可用于產(chǎn)生敲除細(xì)胞或敲除動物。** 基因靶位點可以是任何滿足以下兩點條件的約20nt的DNA序列：**
? ? ?? ??該序列在基因組中是特異存在的。
? ??????靶位點緊鄰著PAM（Protospacer Adjacent Motif）區(qū)并位于PAM區(qū)上游。
PAM序列是結(jié)合靶標(biāo)必不可少的，具體序列取決于Cas9的種類（釀膿鏈球菌Cas9 5’NGG3’）。我們將關(guān)注釀膿鏈球菌Cas9，因其目前廣泛使用于基因工程。一旦表達(dá)，Cas9蛋白和gRNA將形成一個核糖體蛋白復(fù)合物，這個復(fù)合物是通過gRNA的scaffold區(qū)域和Cas9上表面暴露帶正電荷的溝糟相互作用形成的。Cas9與gRNA的結(jié)合后構(gòu)象發(fā)生了改變，分子由無活性的非DNA結(jié)合構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘腄NA結(jié)合構(gòu)象。更重要的是gRNA上的靶位點序列仍未和靶標(biāo)DNA發(fā)生相互作用。Cas9-gRNA復(fù)合體將任意地結(jié)合基因組上的PAM序列，但是只有g(shù)RNA靶位點序列與靶標(biāo)DNA配對時，Cas9才能進(jìn)行切割（這段靶標(biāo)DNA）。一旦Cas9-gRNA復(fù)合物結(jié)合到一段認(rèn)定的DNA靶標(biāo)，在gRNA靶向序列3’端的“種子”序列開始使靶標(biāo)DNA退火。如果種子序列與靶標(biāo)DNA序列配對，gRNA將持續(xù)的沿3’到5’端方向使靶標(biāo)DNA退火。
使用CRISPR/Cas9進(jìn)行敲除
只有當(dāng)gRNA靶位點序列與靶基因有足夠的同源性存在時，Cas9才會作用切割靶基因。拉鏈?zhǔn)降耐嘶饳C(jī)制可能解釋了為什么靶標(biāo)上3’端種子序列上的錯配會完全破壞對靶標(biāo)的切割，而5’端的錯配有可能會對靶標(biāo)進(jìn)行切割。Cas9核酸酶有兩個功能性內(nèi)切酶區(qū)：RuvC和HNH。當(dāng)Cas9與靶基因位點結(jié)合時發(fā)生了第二次構(gòu)象變化，核酸酶功能區(qū)對靶標(biāo)DNA的反向鏈進(jìn)行定位切割。Cas9介導(dǎo)的DNA切割最后結(jié)果是目標(biāo)DNA（PAM序列上游約3～4nt）的雙鏈斷裂（double strand break，DSB）。
雙鏈斷裂后由以下兩種常規(guī)的修復(fù)途徑進(jìn)行修復(fù)：
有效但易錯的非同源末端連接途徑(NHEJ)
低效但高保真的同源性修復(fù)途徑(HDR)
NHEJ修復(fù)途徑是最活躍的修復(fù)機(jī)制，能快速的修復(fù)雙鏈斷裂，但通常會在雙鏈斷裂位點產(chǎn)生小的插入缺失。NHEJ介導(dǎo)的雙鏈斷裂修復(fù)的隨機(jī)性具有重要的實用意義，因為Cas9和gRNA在細(xì)胞群體中的表達(dá)，將產(chǎn)生多種不同的突變。大多數(shù)情況下，NHEJ引起的靶標(biāo)DNA上的小InDels，會導(dǎo)致閱讀框內(nèi)的氨基酸插入缺失，或者移碼突變引起的目標(biāo)基因上ORF提前終止。理想情況下，在靶標(biāo)基因內(nèi)形成功能缺失性的突變。然而，對特定的突變細(xì)胞表型的敲除能力最終取決于殘存的基因功能的劑量。
用Cas9的切口酶提高特異性
當(dāng)gRNAs設(shè)計準(zhǔn)確時，CRISPR/Cas9具有很高的特異性，但是特異性依然是一個主要的關(guān)注點，特別是當(dāng)CRISPR應(yīng)用于臨床時。CRISPR系統(tǒng)的特異性主要取決于gRNA靶向序列特異性如何，即基因靶標(biāo)相比于基因組其余部分的情況。理想狀態(tài)下，gRNA靶向序列與靶標(biāo)DNA具有高度同源，而與基因組上其它位置沒有同源性。（但）現(xiàn)實是，在基因組上，會有另外的位點與指定的gRNA靶向序列部分同源。這些位點被稱為“脫靶”，你在設(shè)計gRNA時需要考慮到這些位點。
用Cas9的切口酶提高特異性
為了優(yōu)化gRNA的設(shè)計，CRISPR的特異性可以通過改造Cas9自身來得到提升。如先前討論那樣，Cas9通過兩個核酸酶功能區(qū)域，RuvC和HNH，的結(jié)合活性來形成雙鏈斷裂。每個核酸酶結(jié)構(gòu)域上精確的氨基酸殘基是已知的，這些殘基序列對內(nèi)切酶的活性至關(guān)重要（在釀膿鏈球菌Cas9中D10A對HNH和H840A對RuvC），Cas9酶的修正版已生成，它僅包含一個催化活性功能域(稱為“Cas9 nickase”)。Cas9切口酶依然基于gRNA的特異性來結(jié)合DNA,但切口酶僅能切開DNA的一條鏈，形成一個切口“nick”,或使單鏈斷開，而不是雙鏈斷裂。使用完好的互補(bǔ)鏈作為模板，DNA上的切口迅速地被HDR途徑（同源性修復(fù)途徑）修復(fù)。因此需要使用兩個切口酶來切割靶標(biāo)DNA的兩條鏈以形成雙鏈斷裂（這種通常被稱為“double nick”或者“dual nickase”CRISPR系統(tǒng)）。這種需求迅猛地增加了靶特異性，因為這和在足夠近的范圍內(nèi)雙鏈斷裂產(chǎn)生的兩個脫靶的nicks的方式截然不同。因此，如果特異性或者減少脫靶的影響是考慮的關(guān)鍵因素，那么就采用雙切口酶方法來產(chǎn)生兩個nick引起的雙鏈斷裂。為了獲得高特異性的基因編輯，切口酶系統(tǒng)也可以聯(lián)合HDR（同源性修復(fù)途徑）介導(dǎo)的基因編輯一起使用。
使用HDR進(jìn)行精確的改造
NHEJ介導(dǎo)的雙鏈斷裂修復(fù)不夠完美，通常會導(dǎo)致基因ORF閱讀框的中斷，HDR能用于產(chǎn)生特異性的核苷酸改變（這也是人們所說的基因“編輯”），這種改變小到單核苷酸改變大到大片段插入（例如，添加一個熒光基團(tuán)或者tag）。
為了利用HDR進(jìn)行基因編輯，一段DNA”修復(fù)模板”序列需要和gRNA+Cas9蛋白／Cas9n蛋白一同轉(zhuǎn)入研究者感興趣的細(xì)胞中。修復(fù)模板必須包含所需編輯位點以及緊鄰靶標(biāo)的上下游同源序列（稱作左右同源臂）。每條同源臂的長度以及結(jié)合位點取決于想要進(jìn)行的改變的大小。修復(fù)模板可以是一個單鏈寡核苷酸/雙鏈寡核苷酸/雙鏈DNA質(zhì)粒，這因不同的應(yīng)用而不同。值得一提的是，修復(fù)模板在基因組DNA不能帶有PAM序列，否則修復(fù)模板將成為Cas9切割的合適目標(biāo)。例如，PAM序列可以進(jìn)行突變處理，以至于不再出現(xiàn)，但是基因編碼區(qū)不受影響（也即，沉默突變）
使用HDR進(jìn)行精確的改造
即使在表達(dá)Cas9、gRNA和外源性修復(fù)模板的細(xì)胞中，HDR效率通常也比較低（低于修飾等位基因的10%）。因此，一些實驗室人為地嘗試加強(qiáng)HDR，有的是在HDR起作用時同步化細(xì)胞周期，有的是通過化學(xué)的或遺傳學(xué)的抑制基因來參與NHEJ。HDR的低效性有許多重要的實用意義。首先，因為Cas9的切割效率相對較高，而HDR效率相對較低，一部分Cas9引導(dǎo)的雙鏈斷裂被NHEJ修復(fù)。也就是說，最后細(xì)胞群體中會包含一些野生型等位基因，NHEJ修復(fù)的等位基因，和/或一些所需的HDR編輯等位基因。因此，需要通過實驗來驗證所需的編輯是否存在，如必要的話，對所需編輯的克隆進(jìn)行分離。
實驗方案—pBUE411-2gR PCR鑒定及測序確認(rèn)（以雙靶為例做個簡單介紹）
1. 登錄到網(wǎng)站http://www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html，篩選靶點。靶點最好帶酶切位點【Cas9切割點（離PAM/NGG 3bp）位于酶切位點中】。也可以手動設(shè)計靶點，然后到http://www.rgenome.net/cas-offinder/網(wǎng)站評估脫靶情況。
安裝PAM，前面10bp特異性序列去搜索? TAGAGACGAT
2. 設(shè)計引物，引物結(jié)構(gòu)如下：
MT1T2-F: AATAATGGTCTCAGGCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
MT1T2-F0: GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGC??
（實際也可以將F，F(xiàn)0可以合并為，F(xiàn)1:ATAATGGTCTCAGGCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
R0，R合并：R1：TTATTGGTCTCTAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCGCTTCTTGGTGCC
MT1T2-R0: NNNNNNNNNNNNNNNNNNNCGCTTCTTGGTGCC
MT1T2-R: ATTATTGGTCTCTAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
將1個19-nt靶點序列替換引物F0/BsF中的19-nt N；另一個19-nt靶點的倒轉(zhuǎn)互補(bǔ)序列替換-R0/BsR中的19-nt N。
Eg：將F和F0 合并 為PRP4-F1：ATAATGGTCTCAGGCGGGAAAGGCATAGAGACGATGTTTTAGAGCTAGAAATAG
PRP4-R1：
TTATTGGTCTCTAAACTTGGATCCGATCTACTATGCGCTTCTTGGTGCCGC
3. PCR擴(kuò)增：以稀釋100倍的pCBC-MT1T2為模板進(jìn)行四引物PCR擴(kuò)增。-BsF/-BsR為正常引物濃度；-F0/-R0稀釋20倍。? 這里F0/R0，F(xiàn)R 一起擴(kuò)增就是為了讓F0R0先擴(kuò)增，再用FR擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，應(yīng)該是之前沒法設(shè)計出那么長的條帶，現(xiàn)在直接用F1R1直接擴(kuò)增。
4. 純化回收PCR產(chǎn)物，建立如下酶切-連接體系（restriction-ligation）：
方法一：
成分 體積 反應(yīng)條件
1. PCR片段(964-bp)? ?????????2ul
2. pBUE411? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 2ul
3. 10xNEB T4Buffer? ?????????1.5ul
4. 10xBSA? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?1.5ul
5. BsaI (NEB)? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?1ul
6. T4 Ligase (NEB)/高濃度? 1ul
7. ddH2O? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?6ul
8. Total ????????????????????????????????15ul
5 hours at 37°C
5 min at 50°C
10 min at 80°C
不要加石蠟油
方法二：【自文獻(xiàn)Analytical Biochemistry 437 (2013) 172–177】
Restriction-ligation reaction
Purified PCR products? ? ? ? ? ? ? ? ? ? each 1-3 μl (20-50 ng)
10x ligase buffer (Promega)? ? ? ? ? ? ? ? 1 μl
T4 DNA ligase (Promega, HC, 20 u/μl)? ? ? 0.5 μl (10U)
BsaI (NEB, 10 u/μl)? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.5 μl (5U)
Sterile water? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? to 10 μl? ? ?
Incubate at 37°C for 2 minutes and 16°C for 5 minutes, both steps are repeated 50 times, followed by incubation for 5 minutes at 80°C (heat inactivation).
5. 取5ul轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)。Kan板篩選。
OsU3-FD3+TaU3-RD=831bp菌落PCR鑒定（表明轉(zhuǎn)化成功），OsU3-FD3和TaU3-FD2測序確認(rèn)（看看序列是否正確）。
注1：菌落PCR及測序引物：
OsU3-FD3 GACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTAC
TaU3-RD: CTCACAAATTATCAGCACGCTAGTC [rc: GACTAGCGTGCTGATAATTTGTGAG]
TaU3-FD: TTAGTCCCACCTCGCCAGTTTACAG
TaU3-FD2: TTGACTAGCGTGCTGATAATTTGTG
基于CRISPR/Cas的植物基因組編輯和基因調(diào)控;?表達(dá)3×FLAG-NLS-zCas9-NLS，目標(biāo)序列插入的gRNA支架(OsU3啟動子)，Bar抗性 ?
關(guān)于3*FLAG標(biāo)簽
1. 這幾種形式的FLAG肯定是有不同的，至少長度不同。為什么要構(gòu)建長度不同的FLAG標(biāo)簽?zāi)?？是這樣的，大多數(shù)情況下FLAG標(biāo)簽會構(gòu)建到蛋白的N端或者C端，而且大多數(shù)情況下蛋白的N端或者C端是游離在蛋白表面的，那么在這種情況下FLAG和3xFLAG沒有什么區(qū)別，抗體都能結(jié)合得到。但是也有時候蛋白末端會被折疊到蛋白內(nèi)部，或者被其他結(jié)合蛋白所遮蔽，那么更長的FLAG更有利于抗體結(jié)合表位的暴露，從而被抗體所結(jié)合。2. 這幾種形式都有相同的地方，就是它們都含有DDDDK，而這個通常是FLAG抗體的結(jié)合表位（抗體結(jié)合表位長度一般為4-7個氨基酸），所以對大家常用的FLAG抗體來說，這幾種標(biāo)簽沒有什么區(qū)別，都可以識別。3. 3xFLAG會的抗體結(jié)合信號會不會比1x的更強(qiáng)？我認(rèn)為不會，抗體結(jié)合的表位長度一般4-7個氨基酸，加上抗體本身非常巨大，抗體產(chǎn)生的空間位阻容不下第二個抗體結(jié)合在同一個3xFLAG上。
NLS
核定位序列(Nuclear localization sequence)或者核定位信號--蛋白質(zhì)的一個結(jié)構(gòu)域，通常為一短的氨基酸序列，它能與入核載體相互作用，使蛋白能被運進(jìn)細(xì)胞核。
f1 origin是f1噬菌體基因組DNA的復(fù)制區(qū)序列（一段DNA序列），可引導(dǎo)單鏈DNA復(fù)制過程。 pUC origin是質(zhì)粒pUC的復(fù)制區(qū)序列（一段DNA序列），可引導(dǎo)雙鏈DNA復(fù)制過程。
