Basic Phage Isolation Techniques
基本噬菌體分離技術(shù)
環(huán)境樣品（1）可以直接接種（2）到分離宿主細(xì)菌的平板上，或者首先富集（3）。在噬菌斑試驗(yàn)平板（4）中獲得斑塊，隨后將噬菌斑純化至少三次（5），然后使用純斑塊生產(chǎn)噬菌體原液（6）。
一、不同分離方法的偏差
分離噬菌體前需要考慮分離的目的，從而選擇合適的方法。如果是為了探究環(huán)境中的優(yōu)勢噬菌體，那么就要在分離的時候避免培養(yǎng)富集，造成偏差。如果是為了篩選用于醫(yī)療的噬菌體，那么就要選擇具有侵染特定菌株、或者寄主范圍廣等特點(diǎn)的噬菌體。
細(xì)菌宿主、培養(yǎng)基（包括營養(yǎng)成分、pH值、鹽度類型和濃度、滲透壓等）、培養(yǎng)溫度和時間、氧含量和其他變量可能導(dǎo)致富集和分離過程中的選擇偏差。
不同類型的噬菌體由于自身特點(diǎn)，在不同分離步驟中有所偏差。比如在空斑實(shí)驗(yàn)或噬菌體富集實(shí)驗(yàn)前需要用物理或化學(xué)方法（離心、過濾、氯仿處理）去除細(xì)菌菌體以及其他雜質(zhì)。過度的離心會去除較大的噬菌體。氯仿可以非常有效地裂解細(xì)菌，去除活細(xì)菌并釋放噬菌體，但它也可能對某些含有脂質(zhì)衣殼（lipid capsid）的噬菌體有害，使之無法侵染宿主細(xì)菌。氯仿處理后一些噬菌體的尾部也會受害，降低噬菌體效價（phage titer）。當(dāng)然，氯仿處理有利于專門分離一些對于氯仿不敏感的噬菌體。
樣品的儲存、冷凍甚至暴露在光線下也會使分離、富集的噬菌體類型產(chǎn)生偏差。這是因?yàn)椴煌氖删w會隨著時間的推移或在不同的物理?xiàng)l件下表現(xiàn)出不同程度的耐久性（durability）。
二、噬菌體斑點(diǎn)試驗(yàn)（Spot Testing)
spot test是指在噬菌斑試驗(yàn)前，可以將少量（5-20 μl）未處理或富集后的噬菌體樣品滴加在細(xì)菌平板上，以簡單、快速地檢測樣品中是否有目標(biāo)噬菌體，以及是否要用這個樣品進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。與噬菌斑試驗(yàn)（plaque assay）不同，spot test產(chǎn)生的斑點(diǎn)可能由多種噬菌體引起，或者由樣品中的一些次生代謝產(chǎn)物（造成此實(shí)驗(yàn)的假陽性）引起。
如果樣品中噬菌體滴度合適，產(chǎn)生可以直接分離的噬菌斑，那么此時spot test可以代替plaque assay（如圖2中白色箭頭指示的區(qū)域）。?如果此實(shí)驗(yàn)沒有產(chǎn)生斑點(diǎn)，還可能意味著樣品可能需要富集、濃縮（見內(nèi)容三）。
三、增加噬菌體濃度
對于一些噬菌體濃度很低的樣品，想要分離噬菌體，首先要富集。
可以通過樣品與目標(biāo)細(xì)菌進(jìn)行過夜液體搖培的方式富集。注意富集條件（培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、搖培時間、所用細(xì)菌等）不同，會造成從樣品中富集的噬菌體的數(shù)量和組成有偏差。
還可以沉淀富集噬菌體，樣品離心以除去碎屑，并通過 0.22 μm 膜過濾，再加入ZnCl2，并將溶液在37°C下孵育。在孵育過程中，噬菌體沉淀，然后通過離心，將噬菌體重懸于更小體積的緩沖液里，以達(dá)到濃縮的目的。
另一種濃縮噬菌體但不使用沉淀劑的方法是使用切向流過濾（TFF）。TFF的優(yōu)點(diǎn)是在低噬菌體濃度下有效，例如噬菌體濃度太低而無法進(jìn)行有效沉淀的淡水或鹽水樣品。
還有一些適用于富集少量、寄主特異性噬菌體的方法，比如將目標(biāo)細(xì)菌寄主固定在0.45μm的濾膜上而不是涂布在固體培養(yǎng)基上，然后將預(yù)處理的（0.22 μm濾膜過濾）的噬菌體樣品通過固定了目標(biāo)細(xì)菌的濾膜。
四、獲得分離毒株和噬菌體純培養(yǎng)液
噬菌斑實(shí)驗(yàn)（plaque assay）分離噬菌體的關(guān)鍵步驟（即如圖1的步驟2、4所示的噬菌斑實(shí)驗(yàn)），通過噬菌斑實(shí)驗(yàn)獲得單個的斑塊，再進(jìn)行至少三輪的純化（即如圖1的步驟5），然后通過直接收集噬菌斑部分的瓊脂或者用滅菌的牙簽挑取，再放入緩沖液中來收集噬菌斑，一般認(rèn)為通過以上步驟即可獲得噬菌體的純培養(yǎng)液。
如圖3的噬菌斑平板中，黑色、紅色和白色箭頭所示的噬菌斑在形態(tài)上有明顯的差別，說明樣品未純化成功。而圖4則表明，樣品純化較好，可以挑取圖4中白色箭頭指示的獨(dú)立的，而非疊加的噬菌斑進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
五、保存噬菌體
按照上述方法，獲得足夠滴度的粗提裂解物（crude lysate），大多數(shù)情況下，經(jīng)過簡單的離心或者過濾，即可獲得用于儲存的噬菌體樣品。
然而，粗提物中有一些雜質(zhì)，比如外源DNA、內(nèi)毒素、細(xì)菌素等，會影響樣品的儲存，純化可以增強(qiáng)噬菌體溶液的穩(wěn)定性。通常使用密度梯度超速離心來純化噬菌體，這個在下方第二個演示視頻中有提及。但是密度梯度離心得到的噬菌體量很小，還可以用更便宜的替代方案，比如陰離子交換色譜法或在高速離心之前使用聚乙二醇 （PEG） 沉淀噬菌體。
六、演示視頻
演示視頻1.?尋找和分離噬菌體
原視頻鏈接：https://www.youtube.com/watch?v=Kt0miFrXMaY
演示視頻2.?純化噬菌體
原視頻鏈接：https://www.youtube.com/watch?v=-t85C04Ueio
