2020年發(fā)表在nature medicine上的sepsis患者外周血pbmc單細(xì)胞圖譜

膿毒癥是一種高死亡率的高發(fā)病，占全球醫(yī)療保健支出的很大一部分。迄今為止，沒有任何用于膿毒癥的診斷性生物標(biāo)志物或靶向治療劑被證明是有用或有效的。這可能是由于多種潛在病原體、感染部位、個(gè)體化宿主免疫反應(yīng)和器官功能障礙表現(xiàn)導(dǎo)致的顯著疾病異質(zhì)性。同樣，目前對(duì)膿毒癥誘導(dǎo)的全身免疫失調(diào)的細(xì)胞和分子基礎(chǔ)的了解十分有限。先前的患者基因表達(dá)譜研究依賴于全血來表征診斷或預(yù)后基因特征，這種方法可以聚合來自許多不同細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄組信號(hào)，很可能丟失來自低占比細(xì)胞的特征，也不能識(shí)別細(xì)胞類型- 特定疾病特征。為了克服這些限制，我們使用單細(xì)胞解析的基因表達(dá)譜來表征膿毒癥患者血液中的免疫細(xì)胞狀態(tài)譜。

1. scRNA-seq defines immune cell states in sepsis patients across multiple clinical cohorts

Fig 1a, b：作者納入了19例HC；
UTI (尿路感染)隊(duì)列：10例Leuk-UTI (UTI with leukocytosis, but no organ dysfunction )，7例Int-URO (UTI with mild or transient organ dysfunction)，10例Urosepsis, URO (UTI with clear or persistent organ dysfunction)。
Bac-SEP隊(duì)列：4例 (bacteremic individuals with sepsis in hospital wards)
ICU隊(duì)列：admitted to the medical ICU either with sepsis (8例, ICU-SEP) or without sepsis (7例, ICU-NoSEP)；
對(duì)所有樣本的外周血PBMC進(jìn)行了單細(xì)胞測(cè)序。

這里不是直接就測(cè)了PBMC，還對(duì)DC做了富集 (LIN^–CD14^–HLA-DR⁺)，然后用cell hashing做了混樣。

Fig 1c-e：患者的年齡、入院時(shí)間、病原等基本信息
Fig 1f：一共得到10654個(gè)PBMC和19806個(gè)DC。

2. Expansion of a monocyte state, MS1, in the blood of subjects with sepsis

Fig 2a, b：注釋得到6類細(xì)胞，二次聚類得到15個(gè)cell state，每個(gè)state具有不同的marker基因。
Fig 2c：隨后作者計(jì)算了大群和亞群在各組間的比例變化，其中作者發(fā)現(xiàn)MS1在Int-URO和URO中比HC和Leuk-URO顯著更高，在Bac-SEP中也升高，ICU-SEP也高于ICU-NoSEP。

鑒于 MS1 在膿毒癥患者中的擴(kuò)增，我們推斷分析 MS1 細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)特征可能會(huì)有助于得到膿毒癥的有用臨床標(biāo)志物并進(jìn)一步了解生物學(xué)機(jī)制。
Fig 2d, e：作者比較了ICU-SEP和ICU-NoSEP中MS1的轉(zhuǎn)錄差異，得到了MS1在ICU-SEP中上調(diào)的基因，其中最顯著的基因包括PLAC8和CLU。
Extended Data Fig. 7d-f：作者對(duì)MS1使用非負(fù)矩陣分解得到5個(gè)模塊 (MS1A-E)
Fig 2f, g：模塊MS1-A主要與線粒體呼吸有關(guān) (MT-ND4, MT-CO3, MT-ATP6)，并且與SOFA評(píng)分(疾病嚴(yán)重程度)正相關(guān)。提示能量代謝改變和敗血癥免疫抑制狀態(tài)之間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)。模塊MS1-B則主要與抗炎和pro-resolving反應(yīng)相關(guān)(S100A8, RETN, ALOX5AP, FPR2)，與疾病嚴(yán)重程度負(fù)相關(guān)。這與患者的早期免疫過度活化而晚期免疫抑制相一致。

Fig 2

Extended Data Fig. 7

附：SOFA評(píng)分

3. Validation of MS1 signatures as markers for sepsis

Fig 3a：為了將作者得到的signature和此前文獻(xiàn)中報(bào)道的分類器做比較，作者使用ROC分析了MS1 fraction、MS1細(xì)胞的PLAC8 + CLU表達(dá)和published gene-based signatures對(duì)sepsis的診斷效能。發(fā)現(xiàn)當(dāng)分析所有的sepsis (Int-URO, URO, Bac-SEP and ICU-SEP) 和對(duì)照 (Control和Leuk-UTI) 時(shí)，MS1 fraction的診斷效能最好。當(dāng)分析ICU-SEP和ICU-NoSEP時(shí)，MS1細(xì)胞的PLAC8 + CLU 表達(dá)具有最準(zhǔn)確的診斷效能。

隨后作者使用了公開的bulk sepsis數(shù)據(jù)集對(duì)該signature的診斷效能進(jìn)行了驗(yàn)證。作者對(duì)spesis數(shù)據(jù)集進(jìn)行了反卷積以推斷其中的MS1 fraction。（和單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組分析揭示結(jié)直腸癌中FAP+成纖維細(xì)胞和SPP1+巨噬細(xì)胞的相互作用有點(diǎn)像哦，先找signature，然后找公開的bulk數(shù)據(jù)集反卷積做驗(yàn)證。）
Fig 3b, d：11個(gè)sepsis數(shù)據(jù)集都顯示其MS1 state的inferred abundance在sepsis患者中更高 (summary effect size of 1.9 across all cohorts, FDR=1.75×10^–30)。而推斷的MS1 fraction在不同數(shù)據(jù)集中都可以被用于sepsis的診斷 (summary AUC of 0.90, range of 0.81–0.98)。
Fig 3c, e：在另外的7個(gè)數(shù)據(jù)集(sepsis vesus ICU control)中，MS1 fraction診斷效能不佳，而PLAC8, CLU 和 MS1 marker 基因 (RETN, CD63, ALOX5AP, SEC61G, TXN 和 MT1X)則可以很好的對(duì)sepsis 和 ICU control 進(jìn)行分類。

Fig 3

This analysis of published transcriptional data implies that MS1 cells are present in people with sepsis across several geographic locations, genetic backgrounds and clinical contexts, and demonstrates the potential utility of MS1-specific gene signatures for the discrimination of sepsis from sterile inflammation.

4. Surface markers for isolation of MS1 cells

為了進(jìn)一步提高M(jìn)S1 signature的細(xì)胞marker utility，作者鑒定出了表面蛋白panel，用于流式鑒別MS1的state。
Fig 3f：在和其他14單核相比的差異基因中，MS1特異性低表達(dá)HLA-DR，高表達(dá)IL1R2。sepsis患者是HLA-DR^loIL1R2^hi。
Fig 3g：此前的文獻(xiàn)報(bào)道sepsis患者存在HLA-DR的低表達(dá)^1,2，但作者發(fā)現(xiàn)HLA-DR^lo在Leuk-UTI中也存在。單獨(dú)的HLA-DR^lo不足以將sepsis 和其它 uncomplicated infection區(qū)分開來。但HLA-DR^loIL1R2^hiCD14⁺細(xì)胞在Int-URO 和 URO中比Control 和 Leuk-UTI 都顯著要高。
Fig 3h, i：而且流式檢測(cè)到的細(xì)胞比例和單細(xì)胞檢測(cè)到的比例呈正相關(guān) (Pearson r = 0.87) 。而且分選的HLA-DR^loIL1R2^hiCD14⁺細(xì)胞可以很好的代表MS1特征。

外周血單核細(xì)胞MHC分子的表達(dá)下調(diào)也出現(xiàn)在：
COVID-19： 重癥COVID-19患者的外周免疫反應(yīng)單細(xì)胞圖譜；
急性川崎病：急性川崎病外周血PBMC單細(xì)胞測(cè)序；
BNT162B2誘導(dǎo)的心肌炎：單細(xì)胞測(cè)序解析BNT162B2誘導(dǎo)的心肌炎中經(jīng)典單核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄改變；
胰腺炎：胰腺炎及恢復(fù)期的外周血/組織單核巨噬細(xì)胞的新亞群及標(biāo)志物
trauma：Previous reports from trauma patients indicate a similar reduction in HLA-DR expression on monocytes during initial injury, with potential link to clinical outcome. (見胰腺炎那一篇)
sepsis：此前有文獻(xiàn)報(bào)道sepsis患者存在HLA-DR的低表達(dá)^1,2，該篇研究顯示單獨(dú)的HLA-DR^lo不足以將sepsis 和其它 uncomplicated infection區(qū)分開來。

Low HLA-DR expression is associated with monocyte immaturity, resulting in decreased responsiveness to stimuli^3,4. （該篇研究顯示這些Low HLA-DR細(xì)胞是骨髓細(xì)胞 分化來的，不是外周細(xì)胞分化來的）

Fig 3

This combination of cell surface markers could be used to purify the cell state for further molecular and functional characterization, or could potentially be employed as a routine tool for rapid quantification of the MS1 fraction in people at risk of sepsis.

5. Generation of MS1-like cells from human bone marrow

由于HLA-DR的低表達(dá)與monocyte immaturity有關(guān)，引起細(xì)胞應(yīng)對(duì)刺激時(shí)的低反應(yīng)性^3,4，作者因此推測(cè)MS1可能來自bone marrow mononuclear cells (BMMCs, 主要包括hematopoietic precursors，而不是外周成熟免疫細(xì)胞)。
Fig 4a：作者發(fā)現(xiàn)使用Pam3CSK4 (Pam3)或LPS慢性刺激BMMCs可以誘導(dǎo)出HLA-DR^loIL1R2^hiCD14⁺細(xì)胞。
Fig 4b：而且HLA-DR^loIL1R2^hiCD14⁺細(xì)胞占CD14⁺細(xì)胞的比例在LPS或Pam3刺激的BM細(xì)胞中呈時(shí)間依賴性增加，而LPS或Pam3刺激的PB細(xì)胞則沒有這種現(xiàn)象。
Fig 4c, d：對(duì)Pam3或LPS慢性刺激BMMCs進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序的結(jié)果顯示，一群顯著高M(jìn)S1 score的細(xì)胞在刺激組存在，在未刺激組不存在。
Fig 4e：軌跡分析顯示：這群MS1-like induced population (iMS1)最初和未刺激的細(xì)胞具有一樣的分化軌跡，但隨后偏離了正常軌跡。
刺激組的progenitor細(xì)胞和未刺激組相比展示出一系列的差異性高表達(dá)基因 (Extended Data Fig. 10h)，包括一些參與inflammation-induced myelopoiesis 基因 (比如 IL3R, IL10R, IFNAR1)，提示外周血中的MS1細(xì)胞可能是sepsis-induced myelopoiesis的結(jié)果。

These results demonstrate the potential of human bone marrow cells as a model for the expansion of the MS1 state in sepsis, and support the hypothesis that the emergence of reprogrammed myeloid cells in the blood stems from dysregulated differentiation of hematopoietic precursors.

6. Epigenomic landscape and transcriptional regulators of MS1 cells

隨后，作者對(duì)PB-Mono (正常外周血單核), PB-MS1 (sepsis患者外周血MS1), BM-Mono (正常骨髓單核細(xì)胞), 和 BM-iMS1 (LPS和HSC刺激BMMCs誘導(dǎo)的單核)進(jìn)行了ATAC-seq。
Fig 4f：PCA結(jié)果顯示PB-Mono和BM-Mono 在PC1和PC2上重疊，而B-MS1 和 BM-iMS1 則具有各自的特征(但具有類似的PC2)
Fig 4g, h：隨后作者進(jìn)行了motif enrichment analysis，PB-Mono 和 PB-MS1的差異性peak包括FOS–Jun, PU.1 和 CEBP motifs，它們都對(duì)單核細(xì)胞的發(fā)育至關(guān)重要。
鑒于此前報(bào)道中這些motif在inflammation-induced myelopoiesis中發(fā)揮重要作用，作者進(jìn)一步分析了CEBP轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。
Fig 4i：Bulk RNA-seq顯示和PB-Mono相比，PB-MS1存在CEBPD 和 CEBPE 的表達(dá)增加以及CEBPG的表達(dá)下降。BM-iMS1和BM-Mono相比也是類似的結(jié)果。
Fig 4j：在iMS1的分化軌跡中也存在著沿時(shí)間軸的CEBPD 和 CEBPE 的表達(dá)上調(diào)以及CEBPG的表達(dá)下降。
有趣的是，前面Extended Data Fig. 7f中顯示CEBPD是MCS1-C模塊的特征基因，提示了其在維持MS1 program中的潛在重要性。

Altogether, these analyses show that MS1 cells have an epigenomic profile markedly different from that of normal CD14+ blood mono- cytes, and that these differences are associated with transcription factors involved in monocyte differentiation. Although in vitro- generated BM-iMS1 do not fully recapitulate the epigenomic land- scape of MS1 cells, the two populations show significant overlap in accessible peaks and share the upregulation of similar transcrip- tional regulators.

Fig 4

7. Functional response of MS1 cells to restimulation

為了比較MS1和其他CD14⁺單核細(xì)胞的functional response，作者分選了四種單核細(xì)胞群，在resting for 24 h后使用100 ng ml^–1 LPS 進(jìn)行了刺激。
Fig 4k：結(jié)果顯示LPS刺激后PB-MS1顯著上調(diào)了細(xì)胞因子分泌和NF-kB通路相關(guān)基因。
Fig 4l-m：但PB-MS1對(duì)LPS的反應(yīng)性和PB-Mono相比顯著下降，BM-iMS1和BM-Mono相比也下降。
Fig 4n：各組差異表達(dá)基因分析顯示PB-MS1存在特異性上調(diào)的基因，包括CLU (one of the genes we propose as a marker for discriminating sepsis from noninfectious inflammation)。此外，值得注意的是NFKBIA (a known inhibitor of inflammatory responses) 在PB-MS1 和 BM-iMS1中都下降，可能與兩群細(xì)胞的blunted response有關(guān)。

Fig 4

This analysis demonstrates that MS1 cells from people with sepsis and those induced from human bone marrow both have a dysregulated response to further bacte- rial stimulation, recapitulating known phenotypes of monocytes in people with sepsis.

參考文獻(xiàn)：

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