1.為什么我的細(xì)胞提取液中沒有目標(biāo)蛋白？
答：原因有很多：
a) 你的細(xì)胞中不表達(dá)這種蛋白質(zhì)，換一種細(xì)胞；
b) 你的細(xì)胞中的蛋白質(zhì)被降解掉了，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；
c) 你的抗體不能識(shí)別目標(biāo)蛋白，多看看說明，看是否有問題。
2.我的細(xì)胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，為什么呢？
答：a) 有沉淀可能因?yàn)槟愕牡鞍讻]有變性完全，可以適當(dāng)提高SDS 濃度，同時(shí)將樣品煮沸時(shí)間延長；
b) 也不排除你的抗原濃度過高，這時(shí)再加入適量上樣緩沖液即可。
3.我做的蛋白質(zhì)分子量很小(10KD),請(qǐng)問怎么做WB？
答：可以選擇0.2μml的膜，同時(shí)縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉(zhuǎn)移。其他按步驟即可。
4.我的目的帶很弱，怎么加強(qiáng)？
答：可以加大抗原上樣量。這是最主要的。同時(shí)也可以將一抗稀釋比例降低。
5.膠片背景很臟，有什么解決方法？
答：減少抗原上樣量，降低一抗?jié)舛?，改變一抗孵育時(shí)間，提高牛奶濃度。?
6.目標(biāo)帶是空白，周圍有背景，是為什么？
答：你的一抗?jié)舛容^高，二抗上HRP 催化活力太強(qiáng)，同時(shí)你的顯色底物處于一個(gè)臨界點(diǎn)，反應(yīng)時(shí)間不長，將周圍底物催化完，形成了空白即“反亮現(xiàn)象”。將一抗和二抗?jié)舛冉档?，或更換新底物。
7.我的膠片是一片空白，是怎么回事？
答：如果能夠排除下面的幾個(gè)問題那么問題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。
a) 二抗的HRP 活性太強(qiáng)，將底物消耗光；
b) ECM底物中H2O2，不穩(wěn)定，失活；
c) ECL底物沒覆蓋到相應(yīng)位置；
d) 二抗失活。
8.我在顯影液中顯影1分鐘和5分鐘后,底片漆黑一片
是什么原因呢?
答：a) 可能是紅燈造成的, 膠片本來就被曝光了，可以在完全黑暗的情況下操作.看是否有改善；
b) 顯影時(shí)間過長。
9.DAB好還是ECM好？
答：DAB 有毒，但是比較靈敏，是HRP 最敏感的底物；ECM結(jié)果容易控制，但被催化時(shí)靈敏度差一點(diǎn)，但如果達(dá)到閥值，就特別靈敏，可以檢測pg 級(jí)抗原。要看你實(shí)驗(yàn)的情況。
10.抗原檢測出的分子量比資料上的大，是怎么回事？
答：a)抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇量，煮沸變性時(shí)間延長，可以打開二聚體；
b)蛋白本身的修飾如：糖基化，磷酸化等。
11.蛋白轉(zhuǎn)移不到膜上，但膠上有，同時(shí)Marker 轉(zhuǎn)上去了。為什么？
答：可能是：
a)樣品濃度過低；
b)轉(zhuǎn)移時(shí)間不夠。
12.磷酸化抗體的檢測樣本制備時(shí)是否一定要加NaF等？
答：NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般最好加。但是不加也可以，大部分時(shí)候是不用加的。
13.要驗(yàn)證某個(gè)細(xì)胞上有無該蛋白的存在，需要做免疫組化和western blot試驗(yàn)嗎？做這兩個(gè)試驗(yàn)時(shí)的一抗和二抗可以共用嗎？
答：① 免疫組化可以用來進(jìn)行定位，但是不能精確定量，而且有時(shí)會(huì)有假陽性，不易與背景區(qū)分；Western blot可以特異性檢測某個(gè)蛋白質(zhì)分子，進(jìn)行定量，但是不能定位。
② 兩種實(shí)驗(yàn)的一抗有時(shí)候不能通用，公司的產(chǎn)品說明一般都會(huì)說明可以進(jìn)行什么實(shí)驗(yàn)，在免疫組化時(shí)，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。
14.電泳中常出現(xiàn)的一些現(xiàn)象
︶ 條帶呈笑臉狀
原因：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好; 電泳系統(tǒng)溫度偏高。
︵ 條帶呈皺眉狀
原因：可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全。
拖尾
原因：樣品溶解不好。
紋理（縱向條紋）
原因：樣品中含有不溶性顆粒。
條帶偏斜
原因：電極不平衡或者加樣位置偏斜。
條帶兩邊擴(kuò)散
原因：加樣量過多。
15.Western blot結(jié)果中背景較高可能的原因及建議
膜封閉不夠
延長封閉的時(shí)間；選擇更加適合的封閉液。
一抗稀釋度不適宜
對(duì)抗體進(jìn)行滴度測試，選擇最適宜的抗體稀釋度。
一抗孵育的溫度偏高
建議4℃結(jié)合過夜。
選擇的膜容易產(chǎn)生高背景
一般硝酸纖維素膜的背景會(huì)比PVDF膜低。
膜在實(shí)驗(yàn)過程中干過
實(shí)驗(yàn)過程中要注意保持膜的濕潤。
檢測時(shí)曝光時(shí)間過長
減少曝光時(shí)間。
16.?Western blot結(jié)果中雜帶較多可能的原因及建議
目的蛋白有多個(gè)修飾位點(diǎn)（磷酸化位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)、乙?；稽c(diǎn)等），本身可以呈現(xiàn)多條帶。
查閱文獻(xiàn)或進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得蛋白序列的修飾位點(diǎn)信息，通過去修飾確定蛋白實(shí)際大小。
目的蛋白有其它剪切本
查閱文獻(xiàn)或生物信息學(xué)分析可能性。
樣本處理過程中目的蛋白發(fā)生降解
加入蛋白酶抑制劑；樣本處理時(shí)在冰上操作。
上樣量過高，太敏感
適當(dāng)減少上樣量。
一抗特異性不高
重新選擇或制備高特異性的抗體。
一抗不純
純化抗體
一抗或者二抗?jié)舛绕?/p>
降低抗體濃度。
17.Western?blot結(jié)果中無信號(hào)或顯示信號(hào)弱
可能的原因及建議
檢測樣本不表達(dá)目的蛋白
選擇表達(dá)量高的細(xì)胞作為陽性對(duì)照，用于確定檢測樣本是否為陰性。
檢測樣本低表達(dá)目的蛋白
提高上樣量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制劑。
轉(zhuǎn)移不完全或過轉(zhuǎn)移
可以用麗春紅染膜并結(jié)合染膠（考馬斯亮藍(lán)）后確定條帶是否轉(zhuǎn)至膜上或轉(zhuǎn)移過頭；適當(dāng)調(diào)整轉(zhuǎn)膜的時(shí)間和電流。
抗體不能識(shí)別測試種屬的相關(guān)蛋白
購買抗體前應(yīng)當(dāng)認(rèn)真閱讀抗體說明書，確定其是否能夠交叉識(shí)別測試種屬的對(duì)應(yīng)蛋白。
一抗孵育時(shí)間不足
建議4℃結(jié)合過夜。
二抗與一抗不匹配
選擇針對(duì)一抗來源的種屬的抗體。
洗膜過度
洗膜時(shí)間不宜過長，加入的去垢劑不宜過強(qiáng)或過多，建議使用0.1%的弱去垢劑Tween-20。
18.其它現(xiàn)象
膜上多處出現(xiàn)黑點(diǎn)或黑斑
原因：抗體與封閉試劑發(fā)生非特異性的結(jié)合。
反白（條帶顯白色）
原因：目的蛋白含量太高或者一抗?jié)舛绕摺?/p>
蛋白分子量偏低或偏高
原因：膠濃度不適合，高分子量要用低濃度膠；小分子蛋白要用高濃度膠。
19.安全問題
操作有毒試劑時(shí)，帶手套和口罩，且操作揮發(fā)性試劑應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。
