核心看點

哺乳動物內(nèi)耳毛細胞（HCs）缺乏自發(fā)再生能力，由遺傳、噪音或衰老等造成的毛細胞損傷會導致不可逆的聽力損失。

內(nèi)耳支持細胞是維持耳蝸結(jié)構(gòu)和毛細胞功能的關(guān)鍵細胞，當前研究界公認其具備轉(zhuǎn)分化為毛細胞樣細胞的巨大潛力。

Notch信號通路在聽覺器官發(fā)育中呈現(xiàn)典型的“劑量依賴性”雙重作用：低強度信號維持前體細胞特性，高強度信號則強烈抑制支持細胞向毛細胞的轉(zhuǎn)分化。

盡管已知Notch配體Jagged1（JAG1）參與維持前體細胞狀態(tài)，但其具體通過何種受體、調(diào)控哪些下游信號通路來影響支持細胞轉(zhuǎn)分化為毛細胞的機制，在既往研究中仍是空白。

摘要

內(nèi)耳耳蝸毛細胞（Hair cells, HCs）是聽覺必需的主要功能細胞，在哺乳動物中沒有再生能力，現(xiàn)實生活中，遺傳因素、噪音、耳毒性藥物或衰老，可通過損害HCs引起不同程度的聽力損傷，在任何一種情況下，這些損害對于沒有再生能力的耳蝸毛細胞的哺乳動物都是不可逆轉(zhuǎn)的。內(nèi)耳另一類重要細胞—支持細胞（Supporting Cells, SCs）對于維持耳蝸結(jié)構(gòu)和毛細胞正常功能至關(guān)重要，目前的研究認為支持細胞具有轉(zhuǎn)分化為HC樣細胞的潛力。

Notch信號通路是一條在進化中高度保守的，決定細胞命運的重要信號通路之一，其在聽覺器官發(fā)育過程中具有兩種截然不同的作用，低強度Notch信號維持前體細胞特性；高強度信號會抑制SCs向HCs轉(zhuǎn)分化，這兩種不同的模式依賴于不同的Notch配體。Notch配體Jagged1（JAG1）在內(nèi)耳耳蝸中表達，并參與維持前體細胞狀態(tài)。然而 JAG1在SCs轉(zhuǎn)分化HC過程中的的具體機制尚不明確。

2025年9月1日，西安交通大學李小軍教授和美國約翰·霍普金斯大學的Angelika Doetzlhofer?團隊在Nature Communications上發(fā)表了題為“The Notch ligand Jagged1 plays a dual role in cochlear hair cell regeneration”的最新研究成果。該研究基于新生鼠耳蝸上皮類器官體系，聚焦JAG1在毛細胞再生中的功能，發(fā)現(xiàn)JAG1的雙重調(diào)控機制：一方面JAG1抑制毛細胞命運穩(wěn)定；另一方面JAG1參與維持支持細胞前體細胞特性，并解析JAG1發(fā)揮功能的分子機制，其通過Notch1/2受體激活 PI3K-Akt-mTOR 信號通路，維持細胞增殖、代謝及前體細胞特性，外源性JAG1可促進成熟耳蝸SCs再生潛能。這些發(fā)現(xiàn)為開發(fā)基于JAG1/Notch信號調(diào)控的耳聾再生療法提供新的理論依據(jù)。

結(jié)果

JAG1在毛細胞再生過程中具有雙重作用

首先，為了解Jag1對于耳蝸支持細胞（supporting cells, SCs）和SC樣K?lliker 細胞（KCs）有絲分裂與再生潛能，研究團隊建立耳蝸類器官培養(yǎng)體系，從P2TetO-Cre; R26rtTA*M2/+; Jag1f/f小鼠（Jag1條件性敲除小鼠，Jag1 cKO）中分離耳蝸上皮細胞，在含多四環(huán)素（dox）條件下培養(yǎng)類器官（圖1b）。分子生物學結(jié)果顯示，Jag1 cKO類器官中細胞內(nèi)JAG1蛋白含量顯著降低（圖1c-d）。培養(yǎng)7天后，發(fā)現(xiàn)Jag1 cKO類器官形成效率和直徑大小下降（圖1e-j），提示了Jag1缺失對耳蝸類器官的形成和生長具有抑制作用。

進一步，研究者借助p27-GFP轉(zhuǎn)基因（在SCs中高表達，KCs中微弱表達）和流式細胞分選技術(shù)（FACS）進行細胞特異性分析，發(fā)現(xiàn)SCs（p27-GFP???）依賴Jag1實現(xiàn)類器官形成與生長，而KCs（p27-GFP???）僅依賴Jag1維持類器官生長，不依賴其進行類器官形成（圖1k-n）。

圖1Jag1缺失對P2耳蝸類器官的形成和生長具有抑制作用

先前研究發(fā)現(xiàn)，抑制Notch信號可刺激小鼠受損耳蝸中未成熟SCs及部分成熟SCs向HCs轉(zhuǎn)分化?；诖?，為明確Jag1缺失是否會提高耳蝸類器官中HC形成速度，研究團隊培養(yǎng)Jag1 cKO類器官，11天后更換分化培養(yǎng)基以誘導HC形成（圖2a）。結(jié)果顯示，Jag1 cKO類器官HCs特異性基因（Myo7a、Pou4f3）表達顯著上升，Myo7a?SOX2?HCs（新生毛細胞）占比達 20%，而對照組僅零星分布（圖2b-d），提示Jag1缺失促進耳蝸毛細胞轉(zhuǎn)分化。同時，細胞特異性分析顯示 p27-GFP??? SCsJag1 cKO類器官中HCs早期特異性基因（Atoh1、Pou4f3、Gfi1）表達顯著升高，免疫染色顯示其新生毛細胞占比顯著增加，且出現(xiàn)中大型毛細胞簇，而p27-GFP??? KCsJag1 cKO類器官中相關(guān)基因僅輕微上升（圖2e-i），提示了SCs轉(zhuǎn)分化為HCs受 JAG1的強抑制調(diào)控。

圖2Jag1缺失會促進SCs轉(zhuǎn)分化為HC

JAG1調(diào)控分子機制

隨后，作者借助轉(zhuǎn)錄組學分析（RNA-seq）發(fā)現(xiàn)，Notch信號效應基因（Hes1、Hey1、HeyL、Sox2）、促生長基因以及調(diào)節(jié)細胞代謝相關(guān)基因顯著下調(diào)；毛細胞特異性基因（Tunar、Pou4f3、Scx）和齒間細胞相關(guān)基因顯著上調(diào)。此外，富集分析結(jié)果提示了Jag1缺失會破壞耳蝸SCs和KCs中的PI3K-Akt-mTOR 信號傳導（圖3）。

圖3?Jag1缺失會降低祖細胞和SCs特異性基因表達，并減弱PI3K-Akt-mTOR信號傳導

為驗證這一假設(shè)，探究團隊繼續(xù)做機制研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Jag1 cKO類器官中PI3K-Akt-mTOR 信號通路關(guān)鍵蛋白（p-Akt、p-4EBP1）的磷酸化水平顯著降低，表明JAG1是該通路的正向調(diào)控因子。在Jag1 cKO類器官中加入不同濃度JAG1-Fc肽（可激活Notch信號）或在野生型類器官中借助慢病毒載體過表達JAG1后，Jag1 cKO類器官和野生型類器官的形成效率、直徑大小及p-Akt、p-4EBP1蛋白水平均顯著增加。進一步驗證了JAG1對該信號通路的調(diào)控作用（圖4）。

圖4 JAG1促進Jag1 cKO類器官生長及PI3K-Akt-mTOR信號通路恢復

Notch調(diào)控機制具有受體特異

此外，作者分離P2野生鼠耳蝸上皮細胞（SCs和KCs）培養(yǎng)類器官，并借助慢病毒載體過表達Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（pLVX-TetOne-EGFP-NICD），在不同劑量DOX（無dox、低劑量、高劑量）條件下觀察類器官形成和大?。▓D5a）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低劑量dox可顯著提升類器官大小和生長速度，高劑量dox則對類器官的形成和生長具有不利影響（圖5b-d）。同時，作者進行雙向驗證，借助Notch信號抑制劑（LY411575）亦發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，即低水平的Notch受體信號促進耳蝸類器官的形成和生長，而高水平的Notch受體信號則具有抑制作用（圖5）。

圖5 低水平Notch受體信號促進耳蝸類器官的形成和生長

出生后早期耳蝸SCs和KCs共表達Notch1、Notch2和Notch3受體，為驗證哪種受體介導JAG1對耳蝸類器官促生長作用，研究團隊分別分離培養(yǎng)Notch1、Notch2和Notch3缺陷的P2鼠耳蝸類器官，發(fā)現(xiàn)Notch1/2 雙敲（Notch1/2?DKO，P2Notch1fl/fl;Notch2fl/fl鼠分離耳蝸上皮細胞，借助LV-Cre感染細胞）類器官中，類器官形成速度、直徑大小顯著下降，p-Akt、p-4EBP1 蛋白水平顯著降低，提示了Notch1 和 Notch2 在調(diào)控耳蝸PI3K-Akt-mTOR 信號中具有冗余功能（圖6）。

圖6 Notch1和Notch2缺失會減少耳蝸類器官的形成和生長，并減弱PI3K-Akt-mTOR 信號傳導

外源性JAG1可促進SCs再生潛力

在耳蝸成熟過程中，SCs轉(zhuǎn)分化HCs能力下降，Notch1信號強度降低。因此，為表征耳蝸成熟過程中Jag1表達量動態(tài)變化，作者借助FACS從P1、P5、P13 Lfng-GFP小鼠分離SCs，并分析Jag1表達量發(fā)現(xiàn)，Jag1mRNA水平隨著耳蝸成熟顯著動態(tài)下調(diào)（圖7a,b）。在P5使用JAG1-Fc肽處理可促進SCs增殖及新生HCs數(shù)量增加，提升P5（開始成熟）耳蝸SCs轉(zhuǎn)分化HCs能力（圖7c-g）。然而，借助雷帕霉素（mTORC1抑制劑）處理可降低JAG1-Fc肽誘導產(chǎn)生的新生毛細胞數(shù)量（圖7h-j），這提示了JAG1通過激活mTOR 信號促進毛細胞形成。

圖7 JAG1-Fc肽通過激活mTOR 信號促進毛細胞形成

最后，作者進行體內(nèi)驗證。早期研究發(fā)現(xiàn)，在圍產(chǎn)期，耳蝸SCs中ATOH1過表達可促進SCs轉(zhuǎn)分化為HCs，但從P7/P8開始，SCs再生能力下降。由于內(nèi)耳結(jié)構(gòu)復雜且存在血迷路屏障，活體遞送對載體的血清型特異性和感染效率要求極為苛刻。本研究中，研究者選用了和元特異性AAV載體（AAVie-ATOH1-EGFP）進行圓窗膜注射（RWM）。基于豐富的血清型庫篩選出的AAVie展現(xiàn)出了對內(nèi)耳支持細胞的精準靶向能力；同時，其高滴度特性與快速的交付周期，為有效突破遞送屏障、并嚴格把握P7這一極短的活體注射時間窗口提供了關(guān)鍵的實驗材料保障。結(jié)果顯示，JAG1-Fc肽與該AAV載體共注射P7小鼠耳蝸后，在P17檢測時耳蝸頂轉(zhuǎn)新生毛細胞數(shù)量顯著提高，提示了外源性JAG1可增強ATOH1誘導的SCs轉(zhuǎn)分化能力。

圖8 JAG1促進ATOH1誘導的SCs轉(zhuǎn)分化HCs

結(jié)論

文中，作者構(gòu)建多種耳蝸類器官培養(yǎng)體系，結(jié)合分子生物學、譜系追蹤、FACS、RNA-Seq等多種技術(shù)手段，闡明JAG1在毛細胞再生過程中的雙重作用機制：JAG1/Notch1/2通過調(diào)控PI3K-Akt-mTOR 信號通路維持支持細胞前體細胞特性，同時參與毛細胞命運抑制的分子機制。進一步研究發(fā)現(xiàn)，JAG1表達隨耳蝸成熟顯著下降，外源性JAG1-Fc肽可通過激活mTOR 信號，恢復成熟耳蝸支持細胞轉(zhuǎn)分化的能力，促進毛細胞再生。該研究揭示了JAG1在毛細胞再生中的核心機制，為耳聾的再生療法提供了新靶點和理論依據(jù)。

FAQ

Q1：為什么在內(nèi)耳基因治療中，常規(guī)的AAV血清型往往“水土不服”？

A：內(nèi)耳具有獨特的“血迷路屏障”，結(jié)構(gòu)封閉且微環(huán)境復雜，常規(guī)的廣譜血清型（如AAV9）很難有效穿透并感染靶細胞。這就要求研究者必須基于豐富的血清型庫進行篩選。例如本研究中使用的AAVie（內(nèi)耳特異進化血清型），就是經(jīng)過針對性篩選或改造的，它能夠突破內(nèi)耳屏障，實現(xiàn)對耳蝸支持細胞的高效轉(zhuǎn)導。

Q2：如何實現(xiàn)AAV對內(nèi)耳特定細胞（如支持細胞 vs 毛細胞）的“精準靶向”？

A：精準靶向通常采用“血清型+特異性啟動子”的雙保險策略。一方面，不同的血清型對內(nèi)耳不同細胞（如內(nèi)毛細胞、外毛細胞、支持細胞）天然具有不同的親和力；另一方面，如本文中使用的AAVie-ATOH1-EGFP，就是在載體構(gòu)建時搭載了特定的啟動子/增強子元件，從轉(zhuǎn)錄層面進一步限制了基因的表達范圍，從而實現(xiàn)對支持細胞的精準靶向，避免脫靶效應。

Q3:AAV在內(nèi)耳研究中還有哪些前沿方向？

A：AAV在內(nèi)耳的應用主要集中在三大塊：基因替代療法：針對單基因突變導致的遺傳性耳聾（如敲除突變基因，遞送正常拷貝）；基因編輯遞送：將CRISPR/Cas9系統(tǒng)通過AAV遞送至內(nèi)耳，實現(xiàn)基因的精準切割與修復；神經(jīng)環(huán)路調(diào)控：利用AAV遞送光遺傳或化學遺傳學工具，研究聽覺通路的神經(jīng)元活動機制。這些高難度實驗，無一例外都高度依賴高純度、高滴度且靶向性優(yōu)異的AAV載體。