慢病毒包裝是借助宿主細(xì)胞組裝復(fù)制缺陷型慢病毒顆粒，用于體外細(xì)胞、體內(nèi)基因遞送的常用分子實(shí)驗(yàn)技術(shù)，廣泛應(yīng)用基因敲入、沉默、過表達(dá)研究。

一、核心原理

依托三代四質(zhì)粒系統(tǒng)，將目的基因、包裝元件、包膜蛋白相關(guān)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)組裝出具備侵染能力、無法自主復(fù)制的病毒顆粒，收集上清即可獲得病毒原液。

維真生物采用的包裝系統(tǒng)是2代包裝系統(tǒng)，即三質(zhì)粒系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括1個(gè)包裝質(zhì)粒(psPAX2)、1 個(gè)包膜質(zhì)粒(pMD2G)、1個(gè)目的基因質(zhì)粒和1株包裝細(xì)胞(293T cell)。下圖是2代慢病毒包裝系統(tǒng)的示意圖：

二、慢病毒包裝流程

1. 目的載體制備

以維真生物擁有目的基因 ORF 的 PENTER 現(xiàn)貨克隆為例。利用維真生物的 ORF 穿梭質(zhì)粒系統(tǒng)，將 ORF 片段從 PENTER 穿梭載體轉(zhuǎn)移至慢病毒載體。

2. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將目的基因質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到 HEK293T 細(xì)胞中。

3. 病毒收獲

轉(zhuǎn)染后約 72 h 離心收集細(xì)胞上清液，過濾并離心，得到非純化的慢病毒液。

4. 純化濃縮

采用蔗糖密度梯度超速離心法對(duì)收集到的慢病毒進(jìn)行純化，該方法利用不同顆粒之間存在的沉降系數(shù)差，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶。

5. 滴度檢測

測定慢病毒滴度，確定有感染能力的慢病毒顆粒數(shù)目。維真生物采用孔稀釋法進(jìn)行慢病毒滴度標(biāo)定?？紫♂尫ㄊ峭ㄟ^數(shù)熒光的方法測定慢病毒滴度，得到的結(jié)果為有感染能力的慢病毒顆粒數(shù)。下圖是維真某慢病毒(3.20×10^8TU/mL)孔稀釋法測滴度時(shí)的熒光圖：